第一章 基因工程技术的诞生
一、填空题
1．基因工程是—-------—年代发展起来的遗传学的一个分支学科。基因工程技术的诞
生，使人们从简单地利用现存的生物资源进行诸如发酵、酿酒、制醋和酱油等传统
的生物技术时代，走向—---------------—-的时代。
2．随着基因工程技术的诞生和发展，人类可以通过—--------------—、——------和—-----------—等三种主要生产方式，大量取得过去只能从组织中提取的珍稀蛋白，用于研究或治病。
3．Cohen等在——年构建了第一个有功能的重组DNA分子。
4．基因工程的两个基本特点是： (1)—————————，(2)————————。
5．基因克隆中三个基本要点是：—---------—；—--------------—和—----------—。
6．—------—年，美国斯坦福大学——————等在—--------——工发表了题为：“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法：含有λ噬菌体基因和E．coli半乳糖操纵子的环状SV40 DNA”的论文，标志着基因工程技术的诞生。这一工作具有划时代的意义，但是他们并没有—--------------------—。
7.克隆基因的主要目的有四：(1)--------------——； (2)———————————；
(3)——------------------；(4)———----———————。
二、选择题(单选或多选)
1．因研究重组DNA技术而获得诺贝尔奖的科学家是( 。 )
(a)A．Komberg (b)W．Gilbert (c)P．Berg (d)B．McClintock
2．第一个作为重组DNA载体的质粒是( )
(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8
3．第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是( )
(a)EcoRI (b)EcoB (c)EcoC (d)EcoRⅡ
4．P.Berg构建SV40二聚体时用了几种不同的酶，其中( )的作用是制造隐蔽的5'端。
(a)末端转移酶 (b)λ外切核酸酶 (c)外切酶Ⅲ (d)DNA连接酶
三、简答题
1．为什么说基因工程技术是60年代末70年代初发展起来的?
2．重组DNA的含义是什么?
3．如何理解基因工程的两个特点?
4．在Cohen构建有生物功能重组体的第一步实验中，用EcoRI切割了R6-5质粒，然后转化E．Coli C600，在卡那霉素抗性子板上筛选到了pSCl02，它是由R6-5的三个EcoRI片段组成，请推测这个质粒具有什么遗传特性?
四、问答题
1．S．N Cohen于1973年构建了三个重组体，pSCl02， pSCl05，pSCl09请说明这三个重组体是如何获得的?各说明了什么?
2．基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的?
五、翻译并解释下列名词
1. genetic engineering
2. Biotechnology
3. cell engineering
4. protein engineering
第二章 基因工程的工具酶
一、填空题
1.严格地说限制性内切核酸酶(restriction endonuclease)是指已被证明是——-------的酶。基因工程中把那些具有识别------------------------------------------的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。
2．—---—--年Luria和Human在T偶数噬菌体对大肠杆菌感染实验中首次发现了细菌的--------------一现象。
3．1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离到一种限制酶，能够特异性的切割
DNA，这个酶后来被命名为------——，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶。
4．通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的—---------—。
5.Ⅱ类限制性内切核酸酶分子量较小．一般在20～40kDa，通常由—-----—亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA，极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNA，或DNA／RNA杂合双链。这类酶的专一性强，它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求，而且对更远的碱基也有要求，因此，Ⅱ类酶既具有—-------—专一性，也具有——------专一性，一般在识别序列内切割。切割的方式有--------——，产生末端的DNA片段或—----—的DNA片段。作用时需要-------------作辅助因子，但不需要—------—和------------——。
6．完全的回文序列具有两个基本的特点，就是：(1)一-------------------------
(2)------------------------------------------------------------------。
7.Ⅱ类限制性内切核酸酶一般识别——----个碱基，也有识别多序列的限制性内切核酸酶。根据对限制性内切核酸酶识别序列的分析，限制性内切核酸酶识别序列具有-----——倾向，即它们在识别序列中含量较高。
8．EcoK是I类限制性内切核酸酶，分子组成是α2β2γ，分子量是300kDa。在这些亚基中，α亚基具有——------作用；β亚基具有——------的活性；γ亚基的作用则是-----------------一。
9．个体之间DNA限制性片段长度的差异叫-------------------------------。
10．限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自—---—，第二、三两个字母取自—------—，第四个字母则用——-----表示。
11.限制性内切核酸酶AcyI识别的序列是5-GRCGYG-3'，其中R——————————，Y———————.
12．在酶切反应管加完各种反应物后，需要离心2秒钟，其目的是—---—和------——-.
13．部分酶切可采取的措施有：(1)—------------------—(2)------------------——
(3)—————————————等。
14.第一个分离的限制性内切核酸酶差异是—-----—；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是—--------------—。
15．限制性内切核酸酶BsuRI和Haelll的来源不同，但识别的序列都是—----------—，
它们属于—---------—。
16．由于DNA是由4种碱基组成的，所以任何限制性内切核酸酶的切割频率的理论值应该是—---------------—。
17．SalI和NotI都是哺乳动物中识别序列稀有的酶，在哺乳动物基因组的5kb片段中，找到NotI切点的概率是—-------—。
18．部分酶切是指控制反应条件，使得酶在DNA序列上的识别位点只有部分得到切割，它的理论依据是--------------——。
19．I类限制酶识别DNA的位点和切割的DNA位点是不同的，切割位点的识别结合有两种模型，一种是—---------—，另一种是一------------------------。
20．限制性内切核酸酶通常保存在---------——浓度的甘油溶液中。
21． 连接酶(Hgase)是一类用于核酸分子连接形成——键的核酸合成酶，有
DNA连接酶和RNA连接酶之分。
22． 原核生物主要有两种类型的DNA连接酶：E.Coli DNA连接酶和T4DNA连接酶。
基因工程中使用的主要是T4 DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的
一种单链多肽酶，分子量为——kDa，由T4噬菌体基因——编码。E.coli DNA
连接酶是由大肠杆菌基因——编码，也是一条多肽链的单体，分子量为
——————kDa。这两种DNA连接酶有两个重要的差异：第一是它们在催化反
应中所用的能量来源不同，T4 DNA连接酶用——， 而E.coli DNA连接酶
则用——作为能源。第二是它们催化平末端连接的能力不同，在正常情况下
只有T4DNA连接酶能够连接平末端，E.Coli DNA连接酶则不能。即使是调整反应
条件，E.coli DNA连接酶催化平末端的连接效率也只有T4 DNA连接酶
的——。
23． DNA连接酶的单位通常用Weiss单位表示，一个Weiss单位是：——
24． DNA聚合酶I是——在1965年从大肠杆菌细胞中分离的，所以又称
为——聚合酶。该酶由大肠杆菌基因——编码，是一种单链球蛋白，
分子量为109kDa，酶蛋白中含有一个Zn原子。
25． T4 DNA聚合酶与Klenow酶一样，具有5’→3’聚合酶和3’→5’外切酶两种活性，
但是它的3’→5’外切酶的活性比Klenow酶强——倍。该酶的3’→5’外切活
性既能作用于单链DNA也能作用于双链DNA，不过作用于—————二链的活性
要强于——链。
26． 反向转录酶(reversetranscriptase)是由—————kDa和—————kDa两个亚单位
组成的二聚体，作用时以RNA为模板合成DNA。
27． 从小牛胸腺中分离纯化的末端转移酶催化的基本反应是将——
——，同时释放出游离的无机磷。催化反应时不需——，但
需要引物，单链DNA是最好的引物，单链DNA受体的长度最短需有——个、
dNTP。具有3’突出末端的双链DNA也是较好的反应底物。二价离子和DNA末端
状态对催化反应影响较大，但是用——作为辅助离子，可以催化任何形式
的末端(突出的、隐含的、平齐的)加接单核苷酸，但突出的3’端效率较高。 以Mn2+
／Mg2+作为辅助因子，只能在单链DNA或双链DNA的3’突出端加尾。
28． S1核酸酶(S1 nuclease)是从米曲霉(Aspergillus oryzae)中分离纯化的一种含——的
金属蛋白，分子量为32kDa,是一种耐热的酶(37～65℃)。
29． 在S1保护实验中， S1切割的温度有两种：20℃和45℃， 这是因为：在20℃时，
一；在45℃时，--------------------------------------------.
30.——————————技术可以用来鉴定DNA分子中与DNA结合蛋白相互作用
的特定序列。
31．真核生物有两种DNA连接酶，连接酶I主要是参与——，．而连接酶
Ⅱ则是参与——。
32．T4RNA连接酶是1972年发现的，并于1977年纯化。该酶是由T4噬菌体基因一----——编码，作用是不需要模板。它在体内的作用是参与T4噬菌体——，
它不参与DNA合成的连接，但在——中可能有作用。
33．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用——切割DNA聚合酶I得到的分
子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1)——；
(2)一的活性。
34．反向转录酶除具有以DNA和RNA为模板合成DNA的5’-→3’合成酶的活性外，
还具有4种酶的活性：(1)——；(2)——；
(3)一；(4)——。
35．RNA连接酶作用时除了需要ATP和Mg2+外，还需要——。
36．DNA聚合酶I是一种单体酶，分子量为109kDa，它含有金属离子——。
37．为了防止DNA的自身环化，可用——脱去双链
DNA——————————————————。
38．T4单核苷酸激酶进行DNA片段的5’端标记时，主要是通过两种反应即——
——和——。
39．CIP催化脱磷酸时有两种最适温度，一种是37℃，适用于——端脱磷酸；另
一种是56℃，适用于——端脱磷酸。
40．λ切核酸酶可从双链DNA的5’端依次切下5单核苷酸，但对不同末端的底物来
说，作用效率不同，——最高，——最低。
41．EGTA是一离子螯合剂。
42．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有——酶的活性，而没
有----------------酶的活性。
43．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用——的
——和——的作用。
44.欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采
用——或--------.
45．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有——的作用，可以将DNA-
RNA杂种双链中的——水解掉。
二、判断题
1．限制与修饰现象是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的修饰和对自身DNA的限制实现的。
2．限制性内切核酸酶在DNA中的识别／切割位点的二级／三级结构也影响酶切效率。一般来说，完全切割质粒或病毒DNA，要比切割线状DNA需要更多的酶，最高的需要20倍。
3．如果限制性内切核酸酶的识别位点位于DNA分子的末端，那么接近末端的程度也影响切割，如HpaⅡ和MboI要求识别序列之前至少有一个碱基对存在才能切割。
4．能够产生防御病毒侵染的限制性内切核酸酶的细菌，其本身的基因组中没有被该核酸酶识别的序列。
5．限制性图谱与限制性片段长度多态性(RFLP)图谱的最显著的区别在于前者是一个物理图谱而后者是一个连锁图。
6．用限制性内切核酸酶HaeⅢ分别切割载体DNA和供体DNA后，可用E.coli DNA连接酶进行连接。
7．已知某一内切核酸酶在一环状DNA上有3个切点，因此，用此酶切割该环状DNA,可得到3个片段。
8．迄今所发现的限制性内切核酸酶既能作用于双链DNA，又能作用于单链DNA。
9．基因工程中使用的Ⅱ类限制性内切核酸酶不仅有内切核酸酶的活性，而且有甲基化酶的活性。
10．DNA多态性就是限制性片段长度多态性。
11．用限制性内切核酸酶PstI切割质粒pBR322后，再用外切核酸酶ExoⅢ进行系列缺失，可得到一系列大小不同的缺失突变体。
12．甘油会使许多限制性内切核酸酶的特异性发生改变，是导致一些酶的星活性的主要原因之一，防止的办法是酶切反应体系中，将甘油的浓度控制在5％以下。
13．具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。
14．从Esherichia coli K中分离的限制性内切核酸酶命名为EcoK.
15．同一种限制性内切核酸酶切割靶DNA，得到的片段的两个末端都是相同的。
16．在限制与修饰系统中，修饰主要是甲基化作用，一旦位点被甲基化了，其他的限制性酶就不能切割了。
17．稀有酶是指那些识别序列很长又不常用的限制性内切核酸酶。
18．T4DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化平末端和黏性末端的连接。
19．T4DNA连接酶和E．coli连接酶都能催化双链DNA和单链DNA的连接。
20．反转录酶能够以单链RNA或单链DNA为模板，在引物的引发下合成一条互补的DNA链。以RNA为模板合成的DNA是互补DNA(complementary DNA，cDNA)。若是以DNA模板合成DNA，dNTP的掺人速度很低(约5个核苷酸／秒)，比T7DNA聚合酶的合成速度差不多低100倍。
21．以RNA为模板，用反转录酶可同时产生单链和双链的cDNA，双链DNA是由自身引物引导合成。但这种自身引物引导的合成效率远低于外加寡核苷酸引物引导的合成。
22．Bal31核酸酶(Bal31nuclease)是Ca2+依赖性的，在反应混合物中加入EDTA便可抑 制它的活性。
23．λ切核酸酶不能在双链DNA的gap和nick处切割DNA。
24．当一个DNA结合蛋白同它识别的核苷酸序列结合以后，就保护了它们的磷酸二酯 键免遭切割，其结果，电泳胶上就有明显可见的空缺带(与对照相比)，这就是DNA足迹法。
25．T4DNA连接酶和E．coli连接酶作用时都需要ATP和NAD+作为辅助因子。
26．多核苷酸激酶之所以能够用于DNA片段的标记，是因为它能够将单个的32p标记的 单核苷酸加到每一DNA链的5，端。
27．在反转录过程中，使用AMV比使用M-MLV可得到较多的产物。
28．真核生物可能有两种DNA连接酶，连接酶I和连接酶Ⅱ都能在DNA合成和连接中 起作用。
29．DNA聚合酶I有三种酶活性，其中3，→ 5，外切核酸酶的活性在较多的dNTP存在 下，常被5，→ 3，合成酶的活性所掩盖。
30．用同一种酶切割载体和外源DNA得到黏性末端后，为防止它们自身环化，要用CIP 将它们脱磷酸。
31．λ切核酸酶的作用产物可以作为末端转移酶的作用底物。
32．用外切酶Ⅲ作系列缺失突变时，可以从突出的3’端开始。
33．nick和gap的含义是不同的，前者指DNA的单链中有较小的缺失，后者仅是断开 了一个磷酸二酯键。
三、选择题(单选或多选)
1．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )是不太恰当。
(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成
(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统
2．RFLP产生自( )
(a)使用不同的限制性内切核酸酶
(b)每种类型的染色体有两条(二倍体)
(c)染色体中碱基的随机变化
(d)Southern印迹
(e)不同探针的使用
3．Ⅱ型限制性内切核酸酶： ( )
(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列
(b)仅有内切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
(c)限制性识别非甲基化的核苷酸序列
(d)有外切核酸酶和甲基化酶活性
(e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
4．Ⅲ型限制性内切核酸酶： ( )
(a)由两个亚基组成，仅识别半甲基化位点。甲基化位点相对于限制位点的位置(上游或下游)决定了DNA是被甲基化还是被限制
(b)不同亚基的识别位点甲基化和限制活性相互排斥：MS亚基促使甲基化，R亚基促使限制
(c)由两个亚基组成，在识别位点附近识别并进行甲基化或限制
(d)在错配修复中起关键作用，因为酶结合到DNA上是以结构扭曲为基础而不是序列错误识别
(e)是光依赖型酶，是嘧啶二聚体进行“光反应”的关键酶，它们能使胸腺嘧啶二聚体间的共价键断裂
5．分析限制性内切核酸酶切割双链DNA所得到的DNA片段的长度有助于物理作图，这是因为：( )
(a)即使只用一种限制酶，因为DNA是线性的，所以也可以迅速确定限制性片段序列
(b)内切酶在等距离位点切割DNA，同时对于每个生物体的长度是特异的
(c)DNA的线性意味着单限制性酶切片段的长度之和等于DNA的总长，而双酶切产生的重叠片段则产生模糊的图谱
(d)这些内切酶的消化活性是物种特异的
(e)这一技术同时为核苷酸序列提供了广泛信息
6．通过限制性片段分析，可以对等位基因进行精确的分析比较，其原因是：( )
(a)限制性内切核酸酶只切割两个变异等位基因中的一个
(b)它利用限制性位点作为遗传标记
(c)一个特定细胞中等位基因的核苷酸序列不会是相同的
(d)它不依赖于变异等位基因产物的功能。
(e)限制性内切核酸酶的切点被限制在DNA的编码区域内
7．限制性片段长度多态性(RFLP)是：( )
(a)用于遗传的“指纹结构”模式分析的技术
(b)二倍体细胞中的两个等位基因限制性图谱的差别
(c)物种中的两个个体限制性图谱间的差别
(d)两种物种个体间的限制性图谱差别
(e)两种酶在单个染色体上限制性图谱的差别
8．为了正确地构建一个真核基因组的物理图谱：( )。
(a)必须有可能清晰地分离各个染色体(通过脉冲场凝胶电泳)
(b)必须从单倍体细胞(配子)中分离DNA，这样避免了由二倍体细胞中同源染色体的存在而产生的干扰信息
(c)必须进行单个染色体分析，这只能在细胞分裂后期进行
(d)必须找到对于每个染色体只切割一次的限制酶
(e)必须首先分离核DNA和细胞器DNA，然后对它们分别作图
9．下面有关限制酶的叙述哪些是正确的?( )
(a)限制酶是外切酶而不是内切酶
(b)限制酶在特异序列(识别位点)对DNA进行切割
(c)同一种限制酶切割DNA时留下的末端序列总是相同的
(d)一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端
(e)一些限制酶在识别位点内相同的位置切割双链DNA，产生平末端
10．因研究λ噬菌体的限制与修饰现象的本质而获得诺贝尔奖的科学家是：( )
(a)J．Lederberg (b)W.Arber (c)H．Smith (d)F.Sanger
11．第一个被分离的Ⅱ类酶是： ( )
(a)Eco K (b)Hind Ⅲ (c)Hind Ⅱ (d)Eco B
12．双链DNA中一段自我互补的序列被称为回文序列，这种序列一般具有下列特征： ( )
(a)有对称轴 (b)两条链的5'→3'方向的序列相同
(c)是Ⅱ类酶的识别序列 (d)可增强基因的表达
13.在下列进行DNA部分酶切的条件中，控制那一项最好?( )
(a)反应时间 (b)酶量
(c)反应体积 (d)酶的温度
14．在下列试剂中，那一种可以螯合Ca2+离子?( )
(a)EDTA (b)柠檬酸钠 (c)SDS (d)EGTA
15．在下列工具酶中，那一种可以被EGTA抑制活性?( )
(a)S1单链核酸酶 (b)末端转移酶 (c)碱性磷酸酶 (d)Bal31核酸酶
16．限制性内切核酸酶可以特异性地识别： ( )
(a)双链DNA的特定碱基对 (b)双链DNA的特定碱基序列
(c)特定的三联密码 (d)以上都正确
17．在下列酶中，催化反应不需要ATP的是( )
(a)EcoK (b)EcoB (c)T4 DNA连接酶 (d)BamHl
18．下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是( )。
(a)Sau3AI (b)E.coRI (c)hind Ⅲ (d)Sau 3A1
19．限制性内切核酸酶的星号活性是指：( )
(a)在非常规条件下，识别和切割序列发生变化的活性。
(b)活性大大提高
(c)切割速度大大加快
(d)识别序列与原来的完全不同
20．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )
(a)甘油含量过高 (b)反应体系中含有有机溶剂
(c)含有非Mg2+的二价阳离子 (d)酶切反应时酶浓度过低
21．DNA被某种酶切割后，电泳后得到的电泳带有些扩散，下列原因中，那一项不太可能?( )
(a)酶失活 (b)蛋白质(如BSA)同DNA结合
(c)酶切条件不合适 (d)有外切核酸酶污染
22．关于回文序列，下列各项中，( )是不正确的
(a)是限制性内切核酸酶的识别序列 (b)是某些蛋白的识别序列
(c)是基因的旁侧序列 (d)是高度重复序列
23．关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( )不太恰当
(a)由作用于同一DNA序列的两种酶构成
(b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
(c)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
(d)不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统
24．T4DNA连接酶是从T4噬菌体感染的E．coli中分离的，这种连接酶( )
(a)催化连接反应时既能以ATP又能以NAD作为能量来源
(b)既能催化平末端连接又能催化黏性末端连接
(c)是一种单肽酶，分子量为74kDa
(d)既能催化单链DNA连接又能催化双链DNA连接
25．DNA连接酶在体内的主要作用是在DNA复制、修复中封闭缺口，( )
(a)将双链DNA分子中的5’磷酸基团同3’-OH末端重新形成磷酸二酯键
(b)作用时不消耗能量
(c)需要Mn2+等二价辅助离子
(d)也可以连接RNA分子
26．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNA互补链时应选用( )
(a)T4DNA聚合酶
(b)Klenow酶
(c)大肠杆菌DNA聚合酶I
(d)T7DNA聚合酶
27．末端转移酶是合成酶类，( )
(a)作用时不需要模板
(b)在Co2+的存在下，可以在突出的3’末端延长DNA链
(c)在C02+的存在下，可以在隐蔽的3’末端延长DNA链
(d)上述说法有两种是正确的
28．在以下关于噬菌体SP6RNA聚合酶特性的描述中，( )是不正确的。
(a)能够特异性识别SP6启动子
(b)可能在DNA模板的切口(nick)处停止
(c)具有抗酸酶活性
(d)用于体外标记RNA探针。
29．在基因工程中，可用碱性磷酸酶( )
(a)防止DNA的自身环化
(b)同多核苷酸激酶一起进行DNA的5’末端标记
(c)制备突出的3’末端
(d)上述说法都正确
30．从E．coli中分离的连接酶： ( )
(a)需要ATP作辅助因子
(b)需要NAD作辅助因子
(c)可以进行平末端和黏性末端连接
(d)作用时不需要模板
31．下列酶中，除( )外都具有磷酸酶的活性
(a)λ核酸外切酶 (b)外切酶Ⅲ
(c)单核苷酸激酶 (d)碱性磷酸酶
32．下列哪一种酶作用时需要引物? ( )
(a)限制酶
(b)末端转移酶
(c)反转录酶
(d)DNA连接酶
33．EDTA是一种螯合剂，可以抑制大多数酶的活性，但在下列酶中，( )不受它的
影响
(a)外切酶Ⅲ (b)EcoRI
(c)Bal31核酸酶 (d)Pstl
11．S1核酸酶的功能是( )
(a)切割双链的DNA (b)切割单链的RNA
(c)切割发夹环 (d)以上有两项是正确的
34．Klenow酶与DNA聚合酶相比，前者丧失了( )的活性。
(a)5’→3’合成酶 (b)3’→5’外切酶
(c)5’→3’外切酶 (d)转移酶
35．用Bal31核酸酶作系列缺失突变时，( )
(a)缺失从一端开始 (b)需要Mg2+作辅助因子
(c)需要Ca2+作辅助因子 (d)以上有两项是正确的
36．在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )
(a)限制性内切核酸酶切除 (b)用3’外切核酸酶切除
(c)用S1核酸酶切除 (d)用5’外切核酸酶切除
37．λ切核酸酶：( )
(a)作用时不需要模板 (b)可以从3’末端降解DNA
(c)可以从nick部位降解DNA (d)可以从gap部位降解DNA
38．T4RNA连接酶： ( )
(a)作用时不需要模板 (b)作用时需要模板
(c)是1972年发现的 (d)是1967年发现的
39．下列DNA不是l》l、切核酸酶作用底物的是( )
(a)具有3’突出端的双链DNA (b)具有5’突出端的双链DNA
(c)切口DNA (d)平末端DNA
40．可以在切口部位起作用的酶是( )
(a) S1核酸酶 (b)外切酶Ⅲ
(c) λ切核酸酶 (d)Bal31核酸酶
四、简答题
1．现分离到X 82噬菌体的一个突变型，它同野生型的噬菌斑相当不同，并已分离到这两种噬菌体的DNA，请设计一个实验，初步鉴定是点突变、插入突变还是缺失突变?
2．说明Sanger DNA测序法的原理。
3．在酶切反应缓冲液中加入BSA的目的是什么?机理是什么?
4．Fredrick和McClarin等用一个由13个碱基对的DNA片段与EcoRI反应，然后分离到酶和DNA共结晶的复合物，通过X射线分析发现了什么?
5．有些噬菌体和质粒常常编码一些抗限制性酶的蛋白以中和宿主的限制系统。你认为噬菌体和质粒还有哪些可能的方式避免宿主的限制作用?
6．某学生在用EcoRI切割外源片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?
7．在序列5’-CGAACATATGGAGT-3’中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?
8．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：
GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA?为什么?
9．用连接酶将Sau 3AI(↓GATC)切割的DNA与经BamHI(G↓GATCC)切割的DNA连接起来后，能够被BamHI切割的机率有多大(用百分比表示)?
10．用Klenow酶填补的办法可使5’黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失?BamHI(G↓GATCC)；Taq I(T↓CGA)，BssHⅡ(G↓CGCGC)。
11．请推测细菌的染色体上是否会有编码识别8个碱基的内切酶?怎样验证?
12．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?为什么?
13． 按适当的顺序，列出将一种mRNA的cDNA克隆到表达载体所用到的酶。
14． 为什么反转录酶在聚合反应中会出错?
15． 什么是测序酶(sequenaseTM)?
16． 什么是S1核酸酶作图(S1nucleasemapping)?
17． 基因工程中，为什么不喜欢用BAP来脱去DNA的5’端的磷酸基团?
18． RNaseA和RNaseH在催化活性和应用上有何不同?
19． 切口移位(nicktranslation)标记DNA前，用DNaseI处理DNA时，应注意什么?
20． 核酸酶与外切核酸酶Ⅲ用于系列缺失突变有什么不同?
五、问答题
1．什么是细菌的限制—修饰系统(restriction-modification system，R-M system)
2．细菌的限制—修饰系统有什么意义?
3．说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
4．I类限制酶具有哪些特点?在基因工程中有什么作用?
5．Ⅲ类限制酶有哪些特点?
6．何谓限制性内切核酸酶的切割频率?
7．什么是限制性内切核酸酶的星号活性?受哪些因素影响?
8．双酶消化法(double digests)绘制限制性内切核酸酶酶谱的原理。
9. 什么是DNA多态性(DNA polymorphism)?
10．限制性片段长度多态性(restriction fragment length po1ymorphism,RFLP).
11．计算下列三种酶各自在某染色体DNA序列上识别位点间的平均距离：
AluI： 5'AGCT 3’ EcoRI： 5'GAATrC 3’
3’TCGA 5’ 3'CTTAGG 5’
AcyI： 5'GPuCGPyC 3’
3’CPyGCPuG 5’
(注：Py=任何一种嘧啶；Pu=任何一种嘌呤)
12．为什么大多数内切酶被称为“限制”酶？
13．据Science杂志报道：一种重要的遗传疾病可由导致DNA中碱基替换的诱变剂在体外进行人工诱导。设计一种快速用以鉴定疾病基因型的检测方法。
14．1967年，有5个实验室几乎同时独立发现了DNA连接酶，每个实验室的实验有什么特点?
15．简述DNA和RNA连接酶的催化反应机制。
16．影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
17．什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
18．如何利用T4DNA聚合酶制备3’隐含末端或双链子末端?
19．如何利用T4DNA聚合酶进行双链DNA的3’末端标记?
20．如何利用T4DNA聚合酶制备平末端?
21．反转录酶有两种类型，一是来源于禽类骨髓母细胞瘤病毒(AMV，avian myeloblastosis virus)，另一种来源于鼠类莫洛尼氏白血病毒(M-MLV,Moloney munne leukemia virus)，它们之间有什么不同?
22．与E．Coli RNA聚合酶相比，细菌噬菌体的SP6 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶和T3
RNA聚合酶具有哪些优越性?
23．什么是多核苷酸激酶的向前反应和交换反应?
24．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?
25．λ切核酸酶(1arabdaexonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
26．Mn2+、Mg2+对DNaseI(deoxyribonucleasel)的活性有什么影响?DNaseI在基因工程中有什么作用?
27．比较S1-Mapphg和Footprinting在原理上、方法上、应用上有何不同?
六、概念题：
1.回文序列
2.同裂酶
3.限制性物理图谱
4.同位酶
第三章 载体
一、填空题
1．基因工程中有3种主要类型的载体：——-------、------------一、-----------.
2. 由于不同构型的DNA插入EB的量不同，它们在琼脂糖凝胶电泳中的迁移率也不同，SC DNA的泳动速度—----------—，OC DNA泳动速度—---------—，L DNA居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。
3.质粒的复制像染色体的复制一样，是从特定的起始点区开始的。然而，质粒的复制可以是—---—向的、或是—----—向的。在杂种质粒中，每个复制子的起点都可以有效地加以使用。但是在正常条件下只有一个起点可能居支配地位。并认为：当某些具有低拷贝数的严紧型质粒与松弛性质粒融合后，在正常情况下—------—的复制起点可能被苯闭。
4.就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：—-----—、—---------—、—----------------—。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。
5.如果两个质粒不能稳定地共存于同一个寄主细胞中，则属于—---------—群，这是因为它们的——————————所致。
6.质粒拷贝数是指细胞中—------------------------—。
7.复制子由三部分组成：(1)—-----------------—---(2)——-----------———— (3)—--------------—。
8.酵母的2μm质粒有------------，可以配对形成哑铃结构。
9.一个带有质粒的细菌在有EB的培养液中培养一段时间后，一部分细胞中已测不出质粒，这种现象叫----------------。
10.pBR322是一种改造型的质粒，它的复制子来源于----——，它的四环素抗性基因来自于—-----------—，它的氨苄青霉素抗性基因来自于—---------—。
11.质粒的消失同染色体基因的突变是不同的，前者不能恢复，后者可以通过—------—恢复该基因的性状。
12.ColEl质粒复制的起始需要三种酶，即—-----------—、一------------和-----。
13．YAC的最大容载能力是—-----------—，BAC载体的最大容载能力是—---------。
14．pSCl01是一种---------——复制的质粒。
15．把那些没有可检测表型的质粒称为—--------------—。
16．转座子主要由下列部分组成：(1)—-----———————(2)---------------——
(3)—----------------—。
17．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过——----和——---两种质粒改造而来。它的复制子来自—----------—，Amp抗性基因则是来自—--------—。
18．在基因型的表示中，符号Ω表示—----------；符号△表示—--------------。
19．噬菌体之所以被选为基因工程载体，主要有两方面的原因： 一是—-----------—；二是----------——。
20．第一个报道的全测序的单链DNA噬菌体是ФX174，DNA长5386个碱基对，共一个基因，为一环状DNA分子，基因组的最大特点是—----------—。
21．λ噬菌体的基因组DNA为———————kb，有——多个基因。在体内，它有两种复制方式，扩增时(早期复制)按—-----—复制，成熟包装(晚期复制)则是按—--------—复制。它有一个复制起点，进行—-------—向复制。λ噬菌体的DNA既可以以线性存在又可以环状形式存在，并且能够自然成环。其原因主要是在λ噬菌体线性DNA分子的两端各有一个——个碱基组成的天然黏性末端。这种黏性末端可以自然成环。成环后的黏性末端部位就叫做——————位点。
22．根据噬菌体的包装能力，将野生型λ噬菌体的基因组DNA改造成插入型载体，该载体的最小分子大小约为————kb，插入的外源片段最大不超过——————kb。
23．野生型的M13不适合用作基因工程载体，主要原因是————和--------------。
24．黏粒(cosmid)是质粒—噬菌体杂合载体，它的复制子来自——、COS位点序列来自—--------—，最大的克隆片段达到—----------—kb。
25．有两类改造型的λ噬菌体载体，即插入型和取代型。从酶切点看，插入型为——个，取代型为——个。
26．野生型的λ噬菌体DNA不宜作为基因工程载体，原因是：(1)---------------— (2)——————————(3)—---------------------—。
27．M13单链噬菌体的复制分为三个阶段：1)————————(2)—-------------—，
(3)———————————。
28．噬菌粒是由质粒和噬菌体DNA共同构成的，其中来自质粒的主要结构是—-----—，而来自噬菌体的主要结构是—-------------------—。
29．M13单链噬菌体基因2和基因4之间的IG区有三个最重要的功能，即(1)————— (2)—------------—(3)—-------------—。
30．野生型的M13有10个基因，分为三个功能集团，其中与复制有关的两个基因是：
——------------------和——-----------------。
31．以丸噬菌体载体和黏粒载体构建文库时，起始DNA的长度是不同的，前者为—----—
kb，后者为————kb。
32．λ噬菌体载体由于受到包装的限制，插入外源DNA片段后，总的长度应在噬菌体基因组的—---------------—的范围内。
二、判断题
1．迄今发现的质粒DNA都是环状的。
2．线性质粒同环状质粒一样都不带有宿主必需的基因。
3．有a、b、c三个质粒，因为a和b能够共存于一个细胞，a和c也可共存于同一个细胞，所以b和c一定能够共存于同一个细胞。
4．插入元件(1S)也是一种转座元件，它除了有转座酶基因外，还有附加基因。
5．如果两个不同的质粒可以稳定地共存于同一个细胞中，这两种质粒则属于同一个不亲和群。
6．一个带有反向重复序列的双链DNA经变性后，复性时其单链可形成发夹环。
7．能够在不同的宿主细胞中复制的质粒叫穿梭质粒。
8．任何一种质粒都可以用氯霉素扩增的方法，增加它的拷贝数。
9．只有完整的复制子才能进行独立复制，一个失去了复制起点的复制子不能进行独立复制。
10．CsCl-EB密度梯度离心法纯化SC DNA原理是根据EB可以较多地插入到SC DNA中，因而沉降速度较快。
11．质粒ColEl同pSCl01共整合后，得到重组质粒pSCl34，具有两个复制起点，这两个起点在任何细胞中都是可以使用的。
12．pBR322可以用于黏性末端连接、平末端连接和同聚物接尾法连接，无论用哪种方法连接，都可以用同一种酶回收外源片段。
13．所谓穿梭质粒载体是能够在两种以上的不同宿主细胞中复制的质粒，所用的复制起点不同。
14．一般情况下，质粒既可以整合到染色体上，也可以独立存在。
15．ColEl是惟一用作基因工程的自然质粒载体，它具有四环素抗性标记，因而很容易选择。
16．某一染色体DNA经内切酶SalI切割后，产生了若干个具有黏性末端的DNA片段，将这些片段分别在T4 DNA连接酶的作用下自身连接成环，然后导人受体细胞，都可以进行独立地复制。
17．如果细菌的某种表型特征在UV处理下丧失后不再恢复，这种表型有可能是质粒赋予的。
18．基因克隆中，低拷贝数的质粒载体是没有用的。
19．取代型载体(replacement vector)是指同一种限制性内切核酸酶在λDNA中具有两个切点。外源DNA通过取代这两个切点问的片段被克隆。
20.现在最常用的pUC载体是pUCl8，它的分子量小，具有多克隆位点和易于选择的分子标记，并且是松弛型复制。另外，这种载体可在辅助质粒的帮助下合成单链DNA．。
21．噬菌粒(phagemid)pUCll8／pUCll9载体是集质粒和丝状噬菌体有利特征于一身的载体，既能合成单链DNA,又能合成双链DNA。
22．λ噬菌体DNA和M13单链噬菌体DNA在成熟前的DNA复制都是用滚环模型。
23．M13噬菌体每个世代裂解宿主后，可释放100个子代噬菌体。
24．以黏粒为载体的重组体虽然在平板上生长的速度不同，但是转化子中插入片段的扩增量是相同的。
三、选择题(单选或多选)
1．线性质粒复制的引物来自于( )
(a)细胞中合成的小分子RNA
(b)自身末端的端粒序列
(c)外加的寡聚DNA
(d)自身断裂的小分子DNA
2．下面关于松弛型质粒(relaxedplasmid)性质的描述中，( )是不正确的
(a)质粒的复制只受本身的遗传结构的控制，而不受染色体复制机制的制约，因而有较多的拷贝数
(b)可以在氯霉素作用下进行扩增
(c)通常带有抗药性标记
(d)同严紧型质粒融合后，杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子
3．基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
(a)pBR322 (b)pSCl01
(c)pUBll0 (d)pUCl8
4．下列哪种克隆载体对外源DNA的容载量最大?( )
(a)质粒
(b)黏粒
(c)酵母人工染色体(YAC)
(d)λ噬菌体
(e)cDNA表达载体
5．反向重复序列：( )
(a)可以回折形成发夹结构 (b)可以是某些蛋白的结合位点
(c)参与转座子的转座 (d)12 1-说法都不对
6．松弛型质粒： ( )
(a)在寄主细胞中拷贝数较多 (b)可用氯霉素扩增
(c)一般没有选择标记 (d)上述(a)、(b)两项正确
7．ColEl是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： ( )
(a)是松弛复制型 (b)具有四环素抗性
(c)能被氯霉素扩增 (d)能产生肠杆菌素
8．同一种质粒DNA，以三种不同的形式存在，电泳时，它们的迁移速率是：( )
(a)OC DNA>SC DNP>LDNA (b)SC DNA>L DNA>OC DNA
(c)L DNA>OC DNA>SC DNA (d)SC DNA>OC DNA>L DNA
9．pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自：( )
(a) ColEl (b)Ri质粒 (c)pSCl01 (d)pUCl8
10．关于质粒的相容性，下面哪一种说法不正确? ( )
(a)不同相容群的质粒能够共存于同一个细胞
(b)质粒可以分成若干个不相容群，但不能分成若干个相容群
(c)如果a、b两种质粒不相容，说明它们的复制机制相同
(d)属于同一个不相容群中的质粒，不仅复制机制相同，而且拷贝数和分子量也相同
11．关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确?( )
(a)在不同的宿主中具有不同的复制机制
(b)在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点
(c)在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶
(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率
12．能够用来克隆32kb以下大小的外源片段的质粒载体是( )
(a)charomid (b)plasmid (c)cosmid (d)phagemid
13．第一个作为重组DNA载体的质粒是( )
(a)pBR322 (b)ColEl (c)pSCl01 (d)pUCl8
14．Ti质粒：( )
(a)可从农杆菌转到植物细胞中
(b)作为双链DNA被转移
(c)在植物中导致肿瘤
(d)介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素
(e)需要细菌的vir基因帮助转移
(f)在植物细胞中作为染色体外质粒
15．限制性内切核酸酶EcoRI在野生型的丸噬菌体DNA中有5个切点、HindⅢ有7个切点，BamHI也有5个切点。调整这些酶切位点的数量，主要通过( )
(a)体内突变 (b)完全酶切后连接
(c)部分酶切 (d)先用甲基化酶修饰后再酶切
16．pBluescriptMl3载体在多克隆位点的两侧引入了T7和T3两个噬菌体的启动子，这样增加了该载体的功能，如：
(a)可以对插入到多克隆位点的外源片段进行转录分析
(b)利用这两个启动子的通用引物进行PCR扩增
(c)利用通用引物进行序列分析
(d)利用这两个启动子进行定点突变
上述四种功能中哪一种是不正确的?( )
17．下面关于细菌人工染色体(BAC)的特征描述，除了( )外都是正确的。
(a)通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了10～100倍
(b)BAC载体在细菌中以环型超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易
(c)BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
(d)克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
18．以黏粒为载体转染受体菌后，平板上生长的菌落会大小不一、生长速度不一的现象，其原因是( )
(a)营养成分不足
(b)重组后的质粒复制不稳定
(c)重组后的黏粒整合到宿主染色体上
(d)重组体中插入片段的大小不同
19．M13K07是一种辅助噬菌体DNA,可用它帮助噬菌粒制备单链DNA,这是因为( )
(a)M13K07能够进行滚环复制，得到大量的单链噬菌体DNA
(b)M13K07能够提供成熟包装的蛋白
(c)M13K07提供了成熟包装所需的信号
(d)M13K07的10个基因都是正常的
20．黏粒(cosmid)是一种人工建造的载体，( )
(a)它具有COS位点，因而可进行体外包装
(b)它具有质粒DNA的复制特性
(c)进入受体细胞后，可引起裂解反应
(d)进入受体细胞后，可引起溶源化反应
21．Mu噬菌体也是一种转座元件，这种转座元件( )
(a)可引起寄主的突变
(b)可用于细胞内的基因工程
(c)具有转座酶基因
(d)以上说法都正确
22.关于M13的IG区，下列说法中哪一项不妥当?( )
(a)具有正负链的复制起点
(b)具有噬菌体DNA被包装的信号
(c)具有150个碱基的AT富集区
(d)具有八个回文序列，可形成五个发夹环
23．M13噬菌体基因组编码10个基因，在它的成熟过程中起调节作用的蛋白是( )
(a)gp2蛋白 (b)gp5蛋白 (c)gp7蛋白 (d)gp9蛋白
四、简答题
1． YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越性？
2．列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
3．什么叫穿梭载体?
4．说明减少质粒和噬菌体载体上某种酶的识别位点的方法和原理。
5．虽然质粒的带动转移给质粒载体的安全性带来一定的困难，但是通过带动转移将质粒转移到特定的受体菌中也是基因工程中常用的实验技术。请举一例说明之。
6．为什么来自HfrⅹF-的重组体几乎总是F-?
7．解释为什么不同的Hfr菌株具有不同的转移起点和方向?
8．怎样从一个E．coli的Hfr菌株中分离到一个F′gal+的菌株?
9．你已经分离了一个新的F因子， 怎样用最简便的方法知道最初的F因子的部分DNA已经被切除，并被一个外源DNA(也就是细菌DNA)所替代?
10．你能用哪一种基因转移的方法确定
(1)Kcoli染色体上一个新发现的基因座在其染色体上的位置；
(2)一个新分离的突变在基因内的位置。
11．用加有注释的图表说明F质粒是怎样从一个P细胞转移到F细胞。并简要说明转移复制如何不同于营养体的复制。
12．在转导过程中，通常需要把受体菌和在供体中生长的噬菌体悬浮液分别铺在选择性培养基上，为什么?
13．如何将野生型的九噬菌体改造成为一个理想的载体?
14．用SalI切割从噬菌体J2分离的DNA时，得到8个片段，分别是： 1.3、2.8、3.6、5.3、7.4、7.6、8.1和11.4kb。但是，用SalI切割从被感染的寄主细胞中分离到的J2噬菌体DNA时，只得到7个片段，分别是： 1.3、2.8、7.4、7.6、8.1、8.9和11.4kb，根据这些结果，您得到哪些信息?
15．在cI基因正常时为什么也会出现浑浊的噬菌斑?不正常则是清亮的噬菌斑?
16．λ噬菌体DNA被包装到噬菌体的头部，需要哪些基本条件?为什么?
五、问答题
1．什么是复制子(replicon)?
2．什么是质粒的相容性?什么是不相容群?机制是什么?
3．什么是质粒的带动转移?
4．说明变性定位法和限制性内切核酸酶定位法研究质粒复制起点的原理。
5．ColEl衍生质粒拷贝数调节机理的机理是什么?
6．R1质粒拷贝数受到怎样的调节控制?
7．质粒如何维持在细胞中的稳定?
8. 引起质粒不相容性的主要原因是什么?
9．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几个方面?
10．请指出质粒pSCl01的一些生物学特性(包括结构和遗传)及在基因工程中的作用。
11．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColEl和pSCl01这两个自然质粒也不尽人意，通常需要进行改造，请问质粒改造包括哪些基本内容?
12．质粒改造的发展过程如何?
13．在质粒中如何增减酶切点?
14．有人用限制性内切核酸酶EcoRl分别切割松弛型质粒ColEl和严紧型质粒pSCl01(各有一个切点)，然后重组连接形成一个杂种质粒pSCl34，请推测这种质粒有什么特性和用途。
15．现分离了4种新的大肠杆菌Hfr菌株，通过中断接合实验，针对每一菌株确定了高频转移的标记基因和它们进入F受体的时间分别为：
Hfrl Hfr2 Hfr3 Hfr4
man 13min mal 29 lys 16 pur 6
标记基因和第一 trp 6 met 14 arg 9 trp 3
次进入的时间 his 23 thr 4 mal 2 thr 31
pur 3 uvr 20 his 32 lac 23
gal 14
(gal、lac、mal、man不能发酵半乳糖、乳糖、麦芽糖和甘露糖；arg、his、met、trp：生长需要精氨酸、组氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、嘌呤和色氨酸；uvr：紫外线敏感)。任何没有给出的标记都是不能高频转移的。上述数据能够说明大肠杆菌的染色体是环状的吗?以分钟表示图距构建一个大肠杆菌染色体的连锁图。假定整个染色体用了100分钟转移，而且苏氨酸被认为位于0分钟或100分钟处。
16．YAC克隆载体常出现哪些问题?
17. 为什么野生型的九噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?
18． 什么是蓝白斑筛选法?
19. 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?
20． 什么是cI筛选法?
21． λ噬菌体载体具有哪些优点与不足?
22． 什么是M13的IG序列区?有何特点和功能?
23． 将野生型的M13改造成基因工程载体，首先是进行酶切位点的改造，请问M13中的EcoRI最初是如何引入的?
24.以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌体的就就一定是重组体?
25．M13系列载体具有那些优缺点？
26．黏粒载体具有哪些特点与不足?
27．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?
第四章 DNA的分离、合成与测序
一、填空题
1．不同的宿主细胞其核酸酶的活性是不同的，如细菌中的HBl01菌株及JM系列的宿
主菌所含核酸酶的活性比DHl、LE392等菌株——----------------。
2．SDS是分离DNA时常用的一种阴离子除垢剂，它有四个作用：
(1)-----------------------一；
(2)-----------------------一；
(3)-------------------------；
(4)-----------------------一;
3．酚是蛋白变性剂，用酚抽提细胞DNA时，具有两方面的作用：(1)----------——
2)----------------------一。
4．用酚—氯仿抽提DNA时，通常要在氯仿或酚—氯仿中加少许异戊醇。这是因为：异戊醇----------------一。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。
5．同其他水解蛋白酶相比，蛋白水解酶K具有两个显著的优点：(1)----------——
(2)—-----------------—。
6．在分离DNA时要使用金属离子螯合剂，如EDTA和柠檬酸钠等，其目的是——
7．用乙醇沉淀DNA时，通常要在DNA溶液中加入单价的阳离子，如NaCl和NaAc，其目的是—------------------。
8． 浓缩DNA的方法有：(1)—-----------------—(2)—----------------------—(3)————————(4)---------------------——。
9．通常可在三种温度下保存DNA：4～5℃、-20℃、—70℃，其中以——最好。
10.用于分离质粒DNA的细菌培养浓度达到0．8X109细胞／ml时，即可通过离心收集菌体。收集菌体使用定角转子，离心的速度以——--------------为宜。
11．引物在基因工程中至少有4个方面的用途：(1)——-------------(2)-------——3)—--------------------—(4)------------------------——。
12．Clark发现用Taq DNA聚合酶得到的PCR反应产物不是平末端，而是有一个突出碱基末端的双链DNA分子。根据这一发现设计了克隆PCR产物的—---------------—。
13．在用SDS分离DNA时，要注意SDS的浓度，0．1％和1％的SDS的作用效果是不同的，前者—------------------—，后者—-----------------------—。
14．碱解法和清亮裂解法是分离质粒的两种常用的方法，二者的原理是不同的，前者是根据—---------------—，后者则是根据—---------------------。
15．在DNA分离过程中，通常要进行透析，其目的是---------------------。
16．在分离质粒DNA的菌体培养过程中，加入氯霉素有两个好处：(1)----------------(2)---------------------——。
17，在DNA分离过程中造成DNA分子断裂的因素很多，主要有(1)—----------------—
(2)------------------——(3)—--------------------—。
18．在分离DNA时，常用—-------------—法、——----------法、———————法及——---------------法等方法去除蛋白质。
19．在DNA保存液中，常加一滴氯仿，主要是起——----------------作用。
20．按照人们的意愿，改变基因中碱基的组成，以达到——---------------的技术称为—-----------------—。
21．1955年，英国剑桥大学的——第一个合成了具有3’，5’—磷酸二酯键的TpT和pTpT为此获得了——-------------年的诺贝尔奖。
22．可以用—-------------------—除去DNA溶液中的氯化铯。
23．在cDNA的合成中要用到S1核酸酶，其作用是切除在—----------------—.
24．在简并引物的设计中，常常要用到dI(次黄嘌呤)，原因是--------------——
25．在分离DNA时，要戴手套操作，原因是—------------------—。
26．乙醇沉淀DNA的原理是-----------------——。
27．简并引物PCR主要是根据蛋白质的氨基酸序列设计——引物来合成相应的基因。
28．超离心法纯化质粒DNA时， 选用CsCl作介质的优点是：
(1)-----------------一
(2)—----------------—，从而使不同分子量的DNA分子得以分开。
29．缺失突变的原理是缺失了---------------一
30．用核酸酶Bal31作系列缺失突变，得到的产物是：--------------———.
31．SSC是由NaCl和柠檬酸钠组成的试剂，其中NaCl的作用是使----------——，而柠檬酸钠的作用是一-----------------------。
32．在重蒸酚中加入0．1％的8—羟基喹啉及少量β—巯基乙醇，不仅可以防止酚的氧化还可以——---------------的活性及——---------------作用。
33．对于HBl01及其衍生株不宜用煮沸法分离质粒DNA，其原因是—----------------—.
二、判断题
1．氯霉素扩增DNA时，加氯霉素的时间是重要的，因为加得太早，菌数不够，加入时间过迟，菌龄过老，容易自溶。
2．所谓引物就是同DNA互补的一小段RNA分子。
3．脉冲凝胶电泳采用一个很强的电场来分离非常长的DNA分子，其原理在于迫使DNA分子根据长度的不同而具有不同的速度，并按大小顺序通过凝胶.
4. Agarose-EB电泳法分离纯化CCC DNA原理是根据EB可以较多地插入到CCC DNA中，因而迁移速度较快。
5．如果PCR的每一次循环都把上一次循环中合成的DNA都加了一倍，那么，10个循环就扩增了1000倍，20个循环就扩增了100万倍，30个循环就扩增了10亿倍.
6．PCR既能用于扩增任何天然存在的核苷酸序列，又能重新设计任何天然核苷酸序列的两个末端。 因此，任意两个天然存在的DNA序列都能快速有效的扩增，并拼接在一起。
7．最有效的制备纯RNA的方法是让其在细胞中超表达，然后提纯。
8．大量制备已被克隆基因编码蛋白产物的常用方法是体外转录和翻译。
9．通过报告基因与来自于目的基因上游和下游各种DNA片段的结合，研究基因的调控序列.
10．温度敏感突变型是非常有用的，在这些突变型中，可以通过对温度的改变控制这些突变体中异常表型的出现。
11．用人工合成的含有所需碱基变化的寡聚核苷酸，可以将特殊突变引入克隆的基因。
12．蛋白质的氨基酸序列中各种重要信号都可以通过短氨基酸序列同报告蛋白的融合进行研究.
13．简并引物是根据已知DNA序列设计的引物群.
14．在DNA贮存液中加一滴三氯甲烷，可防止真菌的污染。
15．密码的偏爱性是指不同种属的生物对简并密码具有不同的使用频率。
16．插入到质粒DNA中的EB可以用正丁醇抽提除去。
17．碱法和煮沸法分离质粒DNA的原理是不相同的。
18．酚法和碱法分离质粒DNA都要用溶菌酶破壁，但碱法用的溶菌酶的浓度要高。
三、选择题(单选或多选)
1．从细胞或组织中分离DNA时，常用蔗糖溶液，目的是：( )
(a)抑制核酸酶的活性
(b)保护DNA，防止断裂
(c)加速蛋白质变性
(d)有利于细胞破碎
2．不是所有松弛型质粒都需要进行扩增的，如pBS、pUC载体系统就不必进行氯霉素扩增，这是因为这些质粒的拷贝数很高，达到( )
(a)30～50 (b)100—200 (c)300～400 (d)500—700
3．在亚磷酰胺化学法合成DNA中，影响产量的最关键步骤是：( )
(a)脱三苯甲基反应 (b)偶联反应 (c)氧化反应 (d)封端反应
4．有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法(Maxam-Gtbert)和酶学序列分析法(Sanger)。酶学测序法的基本原理优点是：( )
(a)碱基与特殊染料间不同的相互作用
(b)一个合成引物的延伸和DNA修复合成的可靠终止
(c)限制性位点与DNA末端标记的相关性
(d)可同时对DNA双螺旋的两条链进行测序
(e)反应是DNA特异的，RNA不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支
5．CsCl-EB密度梯度离心法纯化质粒DNA的原理是：( )
(a)氯化铯可以较多地插入到线状DNA中去
(b)氯化铯可以较多地插入到SCDNA中去
(c)EB可以较多地插入到线状DNA中去
(d)EB可以较多地插入到SCDNA中去
6．关于cDNA的最正确的提法是：( )
(a)同mRNA互补的单链DNA
(b)同mRNA互补的双链DNA
(c)以mRNA为模板合成的双链DNA
(d)以上都正确
7．在分离mRNA的溶液中，Mg2+离子的浓度不能低于0．5mmol／L，因为低了，( )
(a)mRNA会降解 (b)mRNA会沉淀
(c)核糖体解体 (d)mRNA会变性
8．用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为：( )
(a)染色体DNA断成了碎片 (b)染色体DNA分子量大，而不能释放
(c)染色体变性后来不及复性 (d)染色体未同蛋白质分开而沉淀
9．下面哪一种特性不是密码所具有的? ( )
(a)偏爱性 (b)简并性
(c)重叠性 (d)连续性
10．用SDS-酚来抽提DNA时，SDS的浓度是十分重要的，当SDS的浓度为0．1％时，( )
(a)只能将DNA抽提到水相
(b)只能将RNA抽提到水相
(c)可将DNA、RNA一起抽提到水相
(d)DNA和RNA都不能进入水相
11．关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?( )
(a)溶液工的作用是悬浮菌体
(b)溶液Ⅱ的作用是使DNA变性
(c)溶液Ⅲ的作用是使DNA复性
(d)质粒DNA分子小，所以没有变性，染色体变性后不能复性
12．异戊醇的作用是：( )
(a)使蛋白质脱水
(b)使DNA进入水相
(c)帮助DNA进入水相
(d)减少气泡，促进分相
13．松弛型质粒： ( )
(a)在寄主细胞中拷贝数较多
(b)可用氯霉素扩增
(c)一般没有选择标记
(d)只有(a)和(b)是正确的
14．关于PCR扩增停滞的原因有很多种，但下列各项中，( )项不是主要原因。
(a)底物(模板)过剩
(b)dNTP的大量消耗
(c)产物的聚集
(d)非特异性产物的竞争性抑制
15．Clark做了一个有趣的实验，发现Taq DNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的
末端加一个碱基，主要是加( )
(a) dGTP
(b) dATP
(c) dCTP
(d) dTTP
16．在简并引物的3’端尽量使用具有简并密码的氨基酸，这是因为( )
(a)Taq酶具有一定的不精确性
(b)便于排除错误碱基的掺人
(c)易于退火
(d)易于重组连接
17．变色的酚中含有氧化物，这种酚不能用于DNA分离，原因主要是：( )
(a)氧化物可使DNA的磷酸二酯键断裂
(b)氧化物会改变pH值
(c)氧化物同DNA形成复合物
(d)氧化物在DNA分离后不易除去
四、简答题
1．PCR反应包括引物与DNA模板链间的解链与复性。讨论循环温度范围对引物-DNA
双螺旋稳定性的影响及对PCR产率的影响。
2．Sanger的双脱氧法测序的原理。
3．分离DNA时，为什么要在缓冲液中加入一定浓度的EDTA和蔗糖?
4．PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?
5．说明合成接头在基因工程中的主要作用。
6．从细菌中分离总DNA，应采取哪些措施获得高分·子量的DNA?
7．用酚抽提蛋白质时，离心后，为什么蛋白质总是会停留在水相和酚相之间?
8．分离pBR322 DNA可考虑用氯霉素扩增，分离pUCl8质粒DNA则不必用氯霉素扩增，为什么?
9．溶菌酶是破碎细菌细胞的有效方法。但有些细菌的孢子对溶菌酶不敏感，应该如何处理?
10．假定你从黏质沙雷氏菌中克隆了一个基因，并推测可能是依赖于锌的金属蛋白酶，因为它含有两个组氨酸和一个谷氨酸与锌形成锌指结构，请你设计—个方案，改变其中一个组氨酸看看是否改变蛋白酶的活性？
11．你打算扩增下图所示的两段序列之间的DNA，请从所列出的引物中选出合适的一对。
5’-GACCTGTGGAAGC．．．．．CATACGGGATTG-3’
3’-CTGGACACCTTCG……………GTATGCCCTAAC-5’
引物1 引物2
5'-GACCTGTGGAAGC 5’-CATACGGGATTG
5’-CTGGACACCTTCG 5’-GTATGCCCTAAC
5'-CGAAGGTGTCCAG 5’-GTTAGGGCATAC
5'-GCTTCCACAGGTC 5’-CAATCCCGTATG
五、问答题
1． 用于克隆的DNA在质量上有什么要求?
2． 为什么从细胞中分离DNA时往往会断裂？
3． 为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？
4． 为什么氧化变色的酚不能直接用于DNA的分离？
5． 在DNA的分离过程中，酚通常与氯仿联合使用，即使不联合使用也要在苯酚抽提后用氯仿再抽提一次，为什么？
6． 说明溴化乙啶-氯化铯密度梯度离心纯化DNA的原理？
7． 采用什么措施保证DNA化学合成的方向性和专一性？
8． 何为简并引物？
9． 简并引物设计的一般原则是什么？
10．双脱氧法测序的基本原理是什么？
11．在古生物学中，尚不知道恐龙是否是温血爬行动物，而不象今天的变温爬行动物。假如你得到一些恐龙的DNA，你如何通过PCR和基因克隆来检测恐龙是否是温血爬行动物？
第五章 克隆策略与体外重组
一、填空题
1． 克隆策略有三层涵义：(1)第一层是—--------------—；
(2)第二层涵义是—----------------—；
(3)第三层涵义就是-------------------- 。
2． 假定克隆一个编码某种蛋白质的基因，必须考虑其表达的三个基本条件：
(1)—-----------------—(2)——------------------
(3)—------------------—。
3． 现有的基因克隆策略大体上分为三类：—--------------—、—------------—、—--------------—。
4． 受体细胞的感受态是—--------------—。
5． DNA重组连接的方法大致分为四种：(1)—---------------—(2)—------------—
(3)————————————（4)—--------------------—。
6． 平末端连接法(blunt end ligation)的连接效率比黏性末端连接的效率低得多，所以通常在连接反应体系中适量添加促进大分子凝聚的凝聚剂，以提高平末端DNA连接的效率。常用的凝聚剂是--------------——。
7． 一个细菌的表面大约有—-----------—个同DNA结合的位点。
8． 1984年,Hung和Wesink发现如果两个不同的5’黏性末端通过部分填补得到如下的单链突出末端，即可有效地相互连接：(1)—---------------—(2)—----------------— (3)——----------------。
9． 将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称之为含有一个—-------------—，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个—---------------—。
10．将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个—----------—，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个—-------------------—。
11．在构建cDNA克隆之前，可以用—-----------—来富集一特殊的核苷酸序列。做法是用来自于能够产生目的蛋白的细胞mRNA分子同来自于另一类型细胞(不产生这种蛋白质，但亲缘关系密切)的过量mRNA分子杂交。
12．一旦克隆了一个遗传定位的基因，就可以用——技术来鉴定基因组DNA文库中与之相邻的基因克隆。
13．只要知道基因组中某一特定区域的部分核苷酸组成，用—---------—可以将这段DNA进行百万倍的扩增。
14．SD序列是mRNA分子中同——结合的序列，其结构特征是—----------—的全部或一部分。
15．环状质粒的转化效率很低，通常是线性双链DNA转化效率的—-----------—。
16．cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方法，因为它可以用—---------—为模板通过反转录成一个双链的、无——的基因，因而有利于在原核细胞中进行功能表达。
17．产生平末端的方法有：（1）----------------------（2）---------------------（3）----------------------。
18．不同细菌出现感受态的时期是不同的，如肺炎球菌感受态出现的时期是--------------、而枯草杆菌感受态的出现是在---------------------- 。
19．人工感受态的大肠杆菌细胞在温度为—----------—时吸附DNA，—-------—时摄入DNA。
20．感受态细胞是可以诱导的，诱导的方法有—---------—、—----------------—、------------。
21．影响酶切的主要因素之一是底物DNA，底物的影响包括—------------------—，---------------------—，-----------------------，----------------。
22．salI是识别6个核苷酸的酶，其识别切割的理论值是——个碱基就有一个切点，但在哺乳动物中，大约——才有一个切点。
23.在精简基因组文库中，用标记的—------—同未标记的—----------—杂交，最后建成的是——————————库。
24．构建基因组文库时连接方法主要是—-------—；而构建cDNA文库，可用----------或一-------- 。
25．将携带有外源基因并能持久传递给子代的动物称为—---—动物，这些外源基因就叫做————————。
26．提高重组DNA分子对E．coli的转化效率，通常可采取—----------------—处理
和-----------------------一。
二、判断题
1． 外源基因(或DNA片段)插入到某一基因内的位点后，这个基因不再有任何功能。
2． 用不同的产生黏性末端的限制性内切核酸酶分别切割载体和外源DNA，得到的黏性末端是不亲和的黏性末端。
3． 基因组DNA文库是含有某一生物中全部DNA序列随机克隆的克隆群，而cDNA文库是含有某一生物中所有表达基因随机克隆的克隆群。
4．CDNA克隆较之基因组克隆最重要的优越性就是它们含有一个基因的完整序列。
5．通过差示杂交后制备的CDNA文库使克隆那些只在特定分化细胞表达基因的几率大为提高。
6．在染色体步移中，可通过DNA测序知道已到达所感兴趣的基因。
7．一旦有了一套已知顺序的基因组克隆，通过从文库中获得覆盖目的突变基因所在基因组区的所有克隆，就可以进行染色体步移。
8．根据遗传连锁作图把基因定位在基因组中是定位克隆的第一步，它为分离特定的人的基因提供了一个直接而快速的方法。
9． 人工感受态和自然感受态细胞都能吸收线性和环状单链DNA。
10．人工导入基因和正常染色体基因间的同源重组，可以发生基因置换。
11．为了保证重组DNA分子在受体细胞中能够稳定地独立存在下来，通常用rec-r-m-表型的细胞株作为受体菌。
12．线性DNA片段被导人哺乳动物细胞后，在细胞内酶的作用下，很快相互连接成重复的DNA大片段，并能在随机位点整合到染色体中。
13．不匹配的黏性末端是不能通过黏性末端连接的。
14．用限制性内切核酸酶切割载体、供体DNA后，要加入EDTA-SDS中止液使限制性内切核酸酶失活，这样有利于重组连接。
15．限制性内切核酸酶BglⅡ识别的序列为A↓GATC丁， BamHI识别的序列为G↓GATCC，用它们分别切割载体DNA和供体DNA，不必使酶失活，就可以直接通过黏性末端连接法进行连接。
16．具有EcoRⅡ末端的外源片段只能以一个方向插入到EcoRⅡ末端的载体中。
17．不匹配的黏性末端可以通过部分填补后进行连接。
18．低丰度的mRNA不仅拷贝数少，而且种类也少。
19．同聚物接尾法构建重组体，不仅连接效率高，而且也很容易回收插人的片段。
三、选择题(单选或多选)
1． 重叠群(contig)是一群克隆，在这个克隆群体中各个体( )
(a)相互之间重叠
(b)都是来自不同生物的克隆
(c)插入片段位于不同染色体的不同区段
(d)位于同一染色体的不同区段
2． 根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中，
( )是cDNA文库
(a) YAC文库
(b) MAC文库
(c) 扣减文库
(d) BAC文库
3． 下面关于多克隆位点(multipleclonesite,MCS)的描述，不正确的一句是( )
(a)仅位于质粒载体中
(b)具有多种酶的识别序列
(c)不同酶的识别序列可以有重叠
(d)一般是人工合成后添加到载体中
4． 部分填补是DNA体外重组中常用的一种技巧，填补时应( )
(a)控制DNA聚合酶的用量
(b)控制酶反应的时间
(c)限制dNTP的种类
(d)注意只能填补载体
5． 在下列限制性内切核酸酶中，( )的识别序列中有松弛碱基，选用这种酶时要考虑连接后外源DNA的插入方向。
(a)HindⅢ
(b)EcoRⅡ
(c)BamHI
(d)Pstl
6． EcoRI切割载体DNA和供体DNA所产生的片段在用于重组连接前要( )。
(a)用65℃处理5～10分钟使限制性内切核酸酶失活
(b)用CIP处理载体DNA防止自身环化
(c)进行琼脂糖凝胶电泳监测
(d)上述说法都正确
7． 在cDNA技术中，所形成的发夹环可用( )
(a)限制性内切核酸酶切除
(b)用3’外切核酸酶切除
(c)用S1核酸酶切除
(d)用5’外切核酸酶切除
8． 在DNA的酶切反应系统中，通常：( )
(a)用SSC缓冲液
(b)加入Mg2+作辅助因子
(c)加入BSA等保护剂
(d)上述说法中，有两项是正确的
9． 黏性末端连接法，不仅操作方便，而且( )
(a)产生新切点 (b)易于回收外源片段
(c)载体不易环化 (d)影响外源基因的表达
10．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受体菌表型
(a)r+m+rec’
(b)r-m-rec-
(C)r-m-rec+
(d)r+m+rec-
11．关于DNA接头在基因工程中的作用，下列说法中哪一项不正确?( )
(a)给外源DNA添加适当的切点
(b)人工构建载体
(c)调整外源基因的可读框
(d)增加调控元件
12．DNA的结构对转化的影响很大，一般说来，转化效率最高的是：( )
(a)完整的线性双链DNA
(b)单链线性DNA
(c)完整的环状双链DNA
(d)开口的双链环状DNA
13．cDNA文库包括该种生物的( )
(a)某些蛋白质的结构基因
(b)所有蛋白质的结构基因
(c)所有结构基因
(d)内含子和调控区
14．下列关于建立cDNA文库的叙述中，哪一项是错误的?( )
(a)从特定组织或细胞中提取DNA或RNA
(b)用反转录酶合成mRNA的对应单链DNA
(c)以新合成的单链DNA为模板合成双链DNA
(d)新合成的双链DNA甲基化
15．下列对黏性末端连接法的评价中，哪一项是不正确的? ( )
(a)操作方便 (b)易于回收片段
(c)易于定向重组 (d)载体易于自身环化，降低重组率
16．关于cDNA的最正确的提法是：( )
(a)同mRNA互补的单链DNA (b)同mRNA互补的双链DNA
(c)以mRNA为模板合成的双链DNA (d)以上都正确
17．关于感受态细胞性质的描述，下面哪一种说法不正确?( )
(a)具有可诱导性
(b)具有可转移性
(c)细菌生长的任何时期都可以出现
(d)不同细菌出现感受态的比例是不同的
四、简答题
1．cDNA克隆与基因组克隆有何不同?
2．怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoRI限制位点中去?
3．有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失?
4．简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
5．一个双链DNA分子(为5’突出端)可采用哪些方法使之加上dAl00～120的尾巴?
6．酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?
7．何谓YAC?主要特性是什么?
8．Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在哪里?
9．在构建cDNA文库时，为什么常用GC接尾而不用AT接尾法连接?
10．用限制性内切核酸酶切割DNA后，经电泳检查，发现有拖尾现象，其可能的原因是什么?
11．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应注意哪些问题?
12．假定你分离到一个E．coli的Thy-突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli野生型的ThyA基因的序列是已知的)
五、问答题
1．如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法克隆该基因?
2．何谓定位克隆(positional cloning)?
3．何谓染色体步移(chromosome walking)?
4．在染色体步移中，用哪些方法获得克隆的末端?
5．何谓表型克隆(phenotype cloning)?
6．什么是基因文库?
7．什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗传学上的基因库有什么不同?
8．什么是cDNA文库(complement DNA library)?同基因组文库有何差别?
9．黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出这些不足之处。
10．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优缺点?
11．何谓接头连接法(1inker ligation)?
12．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?
13．如何使用甲基化酶对克隆DNA进行保护?有什么意义?
14．何谓稀有酶?(举例说明)
15．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
16．若在进行DNA重叠群分析时，你发现在一个编码有价值但不稳定蛋白质的可读框之后，紧接着另一个可读框，它可在蛋白质的C末端加上一个稳定结构。举出至少两种获得被修饰蛋白产物的方法。
17．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一BglI的切点。现用BglI切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体?
18．限制性内切核酸酶BamH I和PstI切割某一DNA序列，结果示于图20.1。
5’ 3’
- -GGATCC- - Bam HI - -G GATCC- -
- -CCTAGG- - -----→ - -CCTAG G- -
3’ 5’
图-20．1 BamHI和PstI识别序列处的切割，只显示识别位点的核苷酸序列
(1)指出被切割DNA分子的5’端和3’端；
(2)如果你将切割后的DNA同DNA聚合酶、4种dNTP在一起温育，这些DNA末端会有什么样的变化?
(3)经过B中的反应后，你还能够用T4 DNA连接酶将BamHI末端连接起来吗?PstI末端呢?(T4DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端)
(4)(3)中的连接后，能够重新形成BamHI位点吗?PstI位点呢?
第六章 重组克隆的筛选与鉴定
一、填空题
1． 重组体的筛选有两层涵义，一是将------------------------------，二
是将--------------------------------。
2． 目前，在重组体的筛选中，已经发展了许多构思巧妙、具有极高准确性的筛选方法。
大致可以分为： (1)—------------—(2)—------------—(3)——---------------
(4)———————————等。
3． 噬菌斑形成选择法有两种判断标准，一是—---------------------------—，二是--------------------------------。
4． PCR扩增筛选重组体是比较简便的筛选方法，它适合于—------------—
5． 核酸杂交探针可分为两大类： DNA探针和RNA探针。其中DNA探针又分为一-----探针和————————————探针。
6． 如果用限制性内切核酸酶切割双链DNA产生3’突出的黏性末端，则可以用-------进行3’末端标记。如果用限制性内切核酸酶切割DNA产生的是3’突出的黏性末端，可以用—----------—进行3’末端标记。
7． 单链DNA探针的标记可以采用下列方法：(1)—--------—(2)—-----------—(3)—-----------—。
8． 根据Northern杂交的结果可以说明：——-------------。
9． 差示杂交(differential hybridization)技术需要—------------—。
10．RNA分子经凝胶电泳后按大小不同分开，然后被转移到一张硝酸纤维素膜(尼龙膜)上，同一放射DNA探针杂交的技术称--------------——。
11．在——-----------技术中，DNA限制性片段经凝胶电泳分离后，被转移到硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上，然后与放射性的DNA探针杂交。
12．—-------------—使用核酸探针检测细胞和组织中特定核苷酸序列的位置。
13．为了鉴定某一具有特殊功能蛋白质的结构，可以用一个容易检测的报告蛋白制备——，然后跟踪报告蛋白在细胞中的行为即可。
14．可用T4DNA聚合酶进行平末端的DNA标记，因为这种酶具有——----和—-------—的活性。
15．硝酸纤维素膜(NC)结合DNA的能力为——，尼龙膜(Nylon)为
16．如果对一个克隆的基因进行遗传操作，使互补的链转录，会产生同正常的RNA转录物互补的—----------—分子。
17．在Southern印迹中，DNA转移的速度取决于--------------------------------和—---------------—.
18．根据噬菌斑的清晰程度筛选重组体主要是cI基因的一------------——.
19．用不对称PCR合成单链DNA探针时，两个引物的浓度比为：—---------------—.
20．微细胞是一种E．coli的突变体，通常只有正常细胞的——，而且不含——------.
21．点杂交的主要缺点是—----------------------—.
22．根据外源片段提供的遗传表型筛选重组体，必需考虑三种因素： (1)——-------(2)—--------------—(3)——-------------------。
23．阻断翻译杂交法是—------------—同—----------------—的杂交。
24．在切口移位标记探针时，DNAaseI处理DNA的温度应控制在—---------------—，
温度过高，—-------------------—，不利于标记.
25． Northern印迹和Southern印迹有两点根本的区别：
(1)—-------------—
(2)—---------------—.
26．放射免疫筛选的原理基于以下三点： (1)------------------——
(2)—---------—(3)—-----------—。
二、判断题
1． 以λ噬菌体为载体的筛选方法比较简便，凡能形成噬菌斑的就一定是重组体o
2． 核酸杂交探针就是带有放射性标记的DNA分子.
3． 在Northern杂交中，为了防止RNA形成部分环状发夹结构，影响迁移率，所以要用变性缓冲液进行电泳。
4． 探针的离体标记实际上是酶法标记。
5． 切口移位法(nicktranslation)只能标记线性双链DNA不能标记环状双链DNA.
6． 通过原位菌落杂交得到的阳性克隆即是重组体，但不能判断插入的外源基因是否进行了表达。
7． 尼龙膜(nylon membrane)是核酸杂交的一种固体支持物，具有同DNA结合能力强、韧性强，可反复洗脱使用，并且杂交信号本底低等优点，就是成本高。
8． 如果DNA序列的某种变异在群体中是稀有的，称为突变；若是普遍的，则称为多态性。
9． 用寡聚DNA进行高度严紧的杂交可用于胎儿遗传病的诊断，可检测到因单个核苷
酸变化而造成的基因突变。
10．由于基因家族中成员之间是密切相关的，因此可以用其中一个成员作为探针进行高
度严紧的杂交来检测其他成员。
11．通过用化学标记法取代放射性标记法，并采用一种抗体来特异性地识别这种化学修饰，使得原位杂交的分辨率大大提高。
12．在杂交之前先用凝胶电泳将粗提取物中的RNA或DNA分子进行分离，假定杂交后只有一种或少数几种大小的片段被探针杂交上了，就能肯定这种杂交是特异性的。
13．根据某一感兴趣蛋白质的序列、抗原性以及配基结合性质制备探针，可从DNA文库中筛选到相应的基因。
14．如果用其他的方法对某种蛋白质已进行过鉴定，那么要确定某一克隆是否含有该蛋
白编码基因就相当容易了。
15．用DNA探针进行杂交反应非常敏感并具有选择性，可用来测定某一特定DNA序列在细胞基因组中的拷贝数。
16．双重药物选择法富集哺乳动物细胞中稀有重组体的原理是： 一种药物用于选择以任意方式整合外源DNA的细胞，第二种药物杀死带有随机整合DNA的细胞。
17．就像对培养中的鼠胚性干细胞进行遗传操作获得突变鼠一样，用DNA转染培养中的单个植物细胞，能够创造转基因植物。
18． NC(硝酸纤维素膜)和尼龙膜都可作为电转移DNA支持物。
19．单克隆抗体是淋巴细胞和瘤细胞杂交后形成的单个杂交瘤细胞经无性繁殖而产生的特异性抗体。
20．用免疫化学法筛选重组体不需要外源基因的表达。
21．用DNA探针同RNA分子杂交在测定一已知基因在某一细胞中是否表达时是很有用的，但不能用于检测转录起始位点、终止位点或内含子的位置。
22．核酸杂交的原理是根据DNA分子间互补。
23．突出的3’末端或凹缺的3’末端都可以用Klenow大片段酶进行末端标记。
24．用多核苷酸激酶进行5’末端标记前，DNA必须进行脱磷酸，否则无法标记。
25． X-gal显色反应的基本原理是使载体上与受体互补的α肽失活。
26． Northern印迹和Southern印迹的基本原理是一样的，都是用于检测结构基因的表达。
27．在液相—液相和液相—固相杂交中，它们的杂交效率都是一样的。
三、选择题(单选或多选)
1． 下列各项中，需要进行液相杂交的是( )
(a)Southern印迹 (b)Northern印迹
(c)Slot印迹 (d)S1作图
2． 下面关于用T4多核苷酸激酶标记5’端制备探针的描述中( )是不正确的。
(a)既能标记DNA，又能标记RNA
(b)既能标记双链DNA又能标记单链DNA
(c)只能标记突出的5’端不能标记其他类型末端
(d)DNA或RNA必须有5'-OH的存在
3． Southern印迹的DNA探针( )杂交。
(a)只与完全相同的片段
(b)可与任何含有相同序列的DNA片段
(c)可与任何含有互补序列的DNA片段
(d)可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNA片段
(e)以上都是
4． 用下列方法进行重组体的筛选，只有( )说明外源基因进行了表达。
(a)Southern印迹杂交 (b)Northern印迹杂交
(c)Western印迹 (d)原位菌落杂交
5．下列哪一个不是Southern印迹法的步骤?( )
(a)用限制酶消化DNA
(b)DNA与载体的连接
(c)用凝胶电泳分离DNA片段
(d)DNA片段转移至硝酸纤维素膜上
(e)用一个标记的探针与膜杂交
6． 报告基因( )
(a)以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列
(b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区
(c)能用于检测启动子的活性
(d)能用于确定启动子何时何处有活性
7． 当用过量的RNA与有限的DNA杂交时，( )
(a)所有的RNA杂交
(b)所有的DNA杂交
(c)50％的RNA杂交
(d)50％的DNA杂交
(e)没有RNA杂交，所有的DNA复性为双链DNA
8． 在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTG的作用是( )
(a)诱导宿主的α肽的合成
(b)诱导宿主的ω肽的合成
(c)作为酶的作用底物
(d)作为显色反应的指示剂
9． 用菌落杂交法筛选重组体时，( )
(a)需要外源基因的表达 (b)不需要外源基因的表达
(c)要根据克隆基因同探针的同源性 (d)上述说法都正确
10． 微细胞是一种大肠杆菌突变体，( )
(a)它不带任何DNA
(b)它的体积为正常细胞的1／10
(c)它带有染色体DNA，但不能表达
(d)它带有质粒DNA，可以表达
11．切口移位是指在( )作用下，使( )带上放射性标记。
(a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA
(c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA (d)DNA聚合酶Ⅲ，DNA
12．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的( )
(a)DNA (b)RNA (c)抗体 (d)抗原
13．下面关于细菌人工染色体(BAC)的特点描述，除了( )外都是正确的。
(a)通过电激法将大质粒转化大肠杆菌比酵母的转化率提高了10～100倍
(b)BAC载体在细胞中以环型超螺旋状态存在，使分离操作起来相对容易
(c)BAC载体在大肠杆菌宿主保持高拷贝
(d)克隆到BAC载体上的外源片段可以直接进行测序以获得末端序列
14．用免疫化学法筛选重组体的原理是( )
(a)根据外源基因的表达 (b)根据载体基因的表达
(c)根据mRNA同DNA的杂交 (d)根据DNA同DNA的杂交
15．随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?( )
(a)双链DNA、单链DNA、RNA都是可以标记的
(b)不需要用DNaseI预处理
(C)反应时可用Klenow酶
(d)反应时可用DNA聚合酶I
16．在切口移位标记DNA探针时只能使用( )
(a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I
(c)DNA聚合酶Ⅱ (d)DNA聚合酶Ⅲ
17．要对一双链的DNA分子进行3’末端标记，可用( )
(a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I
(c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶
18．关于噬菌斑筛选法的原理，下面哪一种说法不正确?( )
(a)噬菌斑颜色变化 (b)cI基因失活造成的噬菌斑的变化
(c)对IPTG的分解能力 (d)对X-gal的分解与否
19．下列筛选重组体的方法中，不属于遗传学的方法是：( )
(a)插入失活法 (b)显色反应选择法
(c)噬菌斑选择法 (d)R环分析法
四、简答题
1．点印迹与Southern印迹相比，有何优点和缺点?
2．你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据方案，下面一步骤是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自显影片是空白。错在哪里?
3．切口移位(nicktranslation)标记探针的主要步骤有哪些?
4．插入失活和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么?
5．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoRI消化。消化物与酵母DNA连接后转化对两种抗生素都敏感的正coli菌株。
(1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞?
(2)怎样区分接受了插入酵母DNA的质粒的克隆?
6．用EcoRI和HindⅢ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。
7．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?
8．用一限制性内切核酸酶切割Lac+TetR的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac-TetS受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
9． 严紧杂交实验是如何控制的?
10．RNA与基因组DNA复性已被广泛用于检测不同类DNA的转录。DNA驱动的复性头验与RNA驱动的复性实验有何不同?
11．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
五、问答题
1．什么是遗传学检测法?
2．以pBR322 DNA为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。
3．放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?
4．何谓液相杂交?举例说明在分子生物学中的应用。
5．什么是活体标记法(in vivo labeling)?
6．单链RNA作为探针，具有哪些单链DNA探针所没有的优点?
7．什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA?
8．良好的固相支持物必须具备哪些优良特性?
9.以硝酸纤维滤膜(nitrocellulose filter membrane)作为杂交的固相支持物具有哪些
优点？
10．什么是印迹(blotting)杂交?
11．什么是斑点杂交(dot hybridization)与狭缝杂交(slot hybridization)?
12．什么是原位菌落杂交(colony hybridization)?
13．说明Southern杂交的原理和方法。
14．Northern印迹与Southern印迹有什么不同?
15．建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?
第七章 基因工程综合分析题
1．种子在储藏过程中发生了某种变化，使得长成的水稻很容易被一种病原菌感染。据推测可能是某一化学诱导的突变导致一个具有抗菌功能的关键酶丢失。请设计一个实验验证这种推测是否正确，如何使种子重新获得对这种病的抗性?
提示：根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有通过其Ti质粒将细菌DNA带人植物基因组的独特功能。
2．一个人类疾病基因被定位在7号染色体一段140kb的区域内，并已分离到此染色体区段的克隆，但是并不知道该基因定位在此区域的哪一位置。可用什么方法找到该基因?
3． 如何以大肠杆菌质粒DNA为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达?简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。
4． 用BamHI切割一重组质粒DNA分子并从中分离纯化了两个DNA片段，一段捷400bp,另一段长900bp。现在希望将这两个片段重新连接起来，得到如图22．1所不的结果。于是将这两种片段混合起来，并在连接酶的存在下进行温育，分别在30分钟和8小时取样进行凝胶电泳分析，令人惊讶的是，连接产物并非是理想中的1．3kb的重组分子，而是一种复杂的片段模式(图22．2A)。同时发现随着温育时间的延长，较小片段的浓度逐渐降低，大片段的浓度逐渐增加。如果用BamHI来切割连接后的混合物，则起始的片段可以重新产生(图22．2A)。从凝胶中分离纯化出1．3kb的片段，并取出一部分用BamHI进行切割，以检查它
的结构。正如预料的一样，出现了两个原始的带(图22．2B)。但是用EcoRI切割另一部分样品，希望能够产生两个300bp和一个长度为700bp的核苷酸片段，然而，凝胶电泳的结果，令人惊奇(图22．2B)。
(1)在原始连接混合物中为什么有如此多的带? 。
(2)为什么用EcoRI切割纯化的1．3kb连接物会产生那么多的片段?
图
图22．1 杂合基因的结构
5． 四膜虫是一种双核有纤毛的原生动物。小核(微核)含有细胞染色体的主要拷贝，它参与细胞的性接合，而并不在通常的基因表达中起作用。大核(巨核)含有细胞基因组的“工作”拷贝，由大量基因大小的双链DNA片段(微染色体)组成，它们活跃地进行着转录。含有核糖体RNA基因的微染色体拷贝数很多，可以用梯度离心进行分离。在电子显微镜下检查，每一个核糖体微染色体是一种长为21kb的线性结构。 进行凝胶电泳时，核糖体微染色体的迁移也是21kb(图22．3的第一泳道)。但是，如果用限制性内切核酸酶BglⅡ切割微染色体，产生的两个片段(13．4kb和3．8kb)的总和不等于21kb(图22．3的第二泳道)，改用其他的限制性内切核酸酶切割，所产生的限制性片段的总和也都小于21kb，并且不同种酶切割产生的片段总和都不一样。如果施未经切割的微染色体先进行变性和复性处理，然后再进行凝胶电泳，所得到的双链DNA片段只有10．5kb(图22．3第三泳道)；与此相似的是，将Bg／n切割的微染色体进行变性和复性，电泳后，13．4kb的片段被6．7kb的片段所取代(图22．3第四泳道)。请解释为什么限制性片段的总长度不等于21kb?为什么变性和复性之后电泳的结果有所改变?对于核糖体微染色体中的总序列组成你有什么看法?
6． X染色体的失活是一种独特的发育调控机制，它关闭了整个染色体上的所有基因的表达。在人类X染色体中，失活作用涉及到1．5X108以上的碱基对和几千个基因。在女性中，两条X染色体中的任何一条失活所造成的X连锁基因的表达与正常男性单个X染色体上基因表达的结果是相同的。虽然失活的机理仍不了解，一般认为失活作用是在染色体的特定区域即X失活中心开始的，然后扩散到染色体的其他部分。虽然失活染色体上的大多数基因被关闭了，但少数仍有活性，因此，可以推测X的失活作用与X连锁基因的表达模式有关。为了验证这种推测，分离了大量的人的X染色体基因的cDNA并用Northern印迹法检查它们的表达。比较了这些基因在X染色体正常的男性和女性细胞中的表达、在X染色体异常的男性和女性个体中的表达、以及在啮齿动物：人细胞杂交株中的表达，这种杂交株保留了—个失活的人的X染色体(Xi)或是一个有活性的人X染色体(Xa)在四种cDNA中，发现了三种表达模式，A、B、C三种cDNA示于图22．4。
图
图22．4 来自于不同细胞中不同数目、不同类型X染色体的Northern印迹分析
RNA先进行凝胶分离，吸印到硝酸纤维素膜上，同A、B、C三种cDNA混合探针进行杂交，最后进行放射自显影。对应于基因A、B、C的RNA带的位置是通过不同实验测定的
(1)指出每一种表达模式中表达的基因是来自于活性染色体、非活性染色体，还是二者都有。哪一种是最普遍的，哪一种是最特殊的?
(2)根据不正常个体细胞的结果，归纳出一条规律以说明在X染色体失活过程中，有多少染色体被失活，多少保留活性。
7， 许多引起人遗传病的突变都是由单个核苷酸的取代而造成的。寡聚核苷酸的连接作用可提供一个快速检测单个核苷酸差异的手段。这种分析方法要使用成对的寡聚核苷酸： 其中一个被生物素标记，另一个具有放射性标记或荧光标记，图22．5B的一对寡聚核苷酸是为了检测镰形细胞白血病(图22．5A)而设计的。在分析过程中，分别将不同个体的DNA在有DNA连接酶的存在下，两两配对进行寡聚核苷酸杂交。将生物素酰化的寡聚核苷酸结合到固相支持物的抗生物素链霉蛋白上，然后通过放射自显影检查杂交结果，如图22.4C所示。
(1)你认为βA与βs寡聚核苷酸会同时与βAβs DNA杂交吗?
(2)这种分析是怎样区别βAβsDNA的?
图
图22．5 寡聚核苷酸连接分析
(A)β球蛋白基因的β镰形细胞(βs)突变区的序列。(B)用于连接分析的特异性的寡聚核苷酸；
(C)βAβs之间单个碱基差异的检测分析，将生物素酰化的寡聚核苷酸收集在一个点，
然后测定放射性
8． RFLP能够用于跟踪特定染色体区域的遗传。在一定的条件下，可用靠近缺陷基因的RFLP来测定未出生胎儿是否有基因缺失。一对夫妇来进行遗传咨询，他们的第二个孩子出生后不久死于一种遗传性疾病，母亲又一次怀孕了。已夭折的孩子是家系中受此遗传病影响的第二例，另一例是孩子奶奶(父亲的妈妈)的一个兄弟。这对夫妇想知道这次所怀的孩子是否也有这种遗传病。你已经研究过这种病的遗传性，并且知道是由常染色体的隐性基因所引起。在这种致病基因所处的染色体区内，发现整个人群中有几个限制性位点的多态性， 如图22．6A所示， 多态性位点用符号+／-表示。你分离了双亲、祖父母、以及正常孩子的DNA样品，并用限制性图谱来分析它们的特性，结果示于图22．6B.现在开始检测胎儿，请预测什么样的限制性酶切结果表明很可能具有遗传病?
图
图22．6 携带有致病基因染色体的限制性图(A)及来自不同家族成员的限制性模式(B)在(B)中，A、B、C表示多态性位点，圆圈代表女性，方框代表男性，三角代表未出生的孩子
9． 你打算将一个具有KpnI末端的DNA片段克隆到具有BamH工末端的载体中。问题是BamH I和Kpn I的末端是不匹配的，BamH I是5’突出端，Kpn I则是突出的3’端(图22．7)。一位朋友建议用图22．7所示的寡聚核苷酸“片段”来进行连接。你并没有马上意识到这种方法是可行，因为你想到的连接作用需要邻近的5’磷酸和3’羟基。虽然寡聚核苷酸分子被限制性内切核酸酶切割后会产生合适的末端，但是，合成的寡聚核苷酸的末端都是羟基。另外，虽然图22．7中接头是BamH I-Kpn I，但另一个接头却是Kpn I-BamH I，你怀疑相同的寡聚核苷酸是否能够适合这两种方式的连接。
图
图22．7 用一种寡聚核苷酸片段连接不互补的限制性末端的图解
(1)画出Ken I—BamH Ⅱ结合体和所需要的寡聚核苷酸片段的图，这种寡聚核苷酸与图22．7所示的是否相同?
(2)画出用连接酶处理过的分子图，指明被连接的缺口.
(3)你朋友的图解方法有效吗?
10．λYES(酵母—大肠杆菌穿梭载体)是构建cDNA文库的高效载体，这种载体是λ噬菌体基因组与一个在大肠杆菌和酵母中都能复制的质粒巧妙结合而成，它兼有病毒和质粒载体的优点。cDNA被插入载体的质粒部分，然后它能在体外被包装入病毒颗粒中，包装起采的载体感染大肠杆菌的效率比质粒本身要高得多。一旦进入了大肠杆菌，XYES中的质粒序列能够被诱导重组出入基因组，并进行独立复制，这就可以从质粒中分离出来，以便进行进一步的遗传操作。为了最大限度地提高克隆效率，载体用只有一个切点的限制性内切核酸酶XhoⅠ(5'-C↓TCGAG)进行切割，然后在dTTP存在的情况下，同DNA聚合酶一起进行温育。将一种具有平末端的双链cDNA同一段含由两段寡聚核苷酸组成的双链寡聚核苷酸接头连接起来，这两段寡聚核苷酸的序列是：5，—CGAGATTTACC和5’—GGTAAATC，它们的5’端都是磷酸。然后将载体和cDNA混合并连接在一起。采用这种方法用2μg的载体和O．1μg的cDNA，构建了一个有4X107个克隆的cDNA文库。问：
(1)假定载体长为43kb，cDNA的平均长度是lkb，请估计在连接混合物中，载体分子同cDNA的比例是多少?
(2)在此过程中，载体分子转变成重组体的频率是多少(每对核苷酸的平均分子量是660Da)?
(3)说明怎样处理载体和cDNA分子，才能把它们连接到一起。处理过的载体本身能自连吗?cDNA呢?
(4)载体和cDNA分子要经过怎样的处理才能提高产生重组DNA分子的效率?
(5)能够用XhoⅠ从重组质粒中切出cDNA吗?
11．一个癌基因，从序列上看似乎编码一个转录因子。当放在细胞中表达时，该基因的产物是完全不溶的，这阻碍了对其功能的直接检测，免疫染色表明，这种蛋白定位于细胞核内，如同推测的一样，是一种转录因子。如果能够测出它所结合的DNA序列，就可以通过现有的序列资料中查找已知基因启动子的天然位点，从而能够找到它所调节的基因。有人建议用PCR扩增同该蛋白结合的微量DNA，思路(图22．8)是：(1)合成一组长为26个碱基的随机序列的寡聚核苷酸混合体，在该序列的两侧各有一段25个碱基的序列作为PCR扩增的引物位点(图22．8A)；(2)把这些寡聚核苷酸加到含有转录因子的细胞粗提取物中，转录因子可以同含有结合位点的寡聚核苷酸结合；(3)用转录因子特异的抗体分离同转录因子结合的寡聚核苷酸；(4)用PCR扩增选择到的寡聚核苷酸进行序列分析。按照这一思路，用0．2ng单链随机序列的寡聚核苷酸开始了这项实验，这个寡聚核苷酸可以同一个PCR引物结合成部分双链，经过如图22．8B所示的四轮选择和复制后，用BamHⅠ和EcoRⅠ消化分离到的DNA，将片段克隆到质粒中去，并测定了10个独立的克隆(表22．1)，问：
(1)转录因子结合的保守序列是什么?
(2)结合的保守序列具有对称性吗?也就是说，具有回文结构吗?据此，能否判断转录因子是以单体还是以二聚体的形式同DNA结合?
(3)在0．2ng的样品中有多少单链的寡聚核苷酸?(一个核苷酸的平均质量是330Da)。
图22.8
表22.1
（4）假定实验开始时所用的寡聚核苷酸混合物中，每一个中心部位的26个核苷酸组成确实是随机的，那么有没有可能所有长14bp的序列都存在于开始的样品中呢?
12．打算将一个cDNA克隆到一个表达载体，以便在E．coli中大量制备相应的蛋白质。这个cDNA的两侧具有BamHI的位点，因此计划将它从BamHⅠ的位点插入载体中。实验严格地按照克隆手册中的方法进行：载体用BamHⅠ切割以后，立即用碱性磷酸酶处理，除去5’磷酸。接着将处理过的载体同用BamHI切割的cDNA片段混合，加ADNA连接酶后进行温育，连接之后，将DNA同已处理过的可以接受DNA的细菌感受态细胞混合。最后，将混合物涂布在加有抗生素固体培养基的平板上。由于载体上带有抗生素的抗性基因，所以，转化的细菌能够存活。实验中同时设置了4个对照：
对照1： 将未同任何载体接触过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对着2： 将未切割载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对着3： 将经切割(但未用碱性磷酸酶处理)并用连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上；
对照4： 将经切割(并用碱性磷酸酶处理过)并用DNA连接酶连接(但没有cDNA片段)的载体转化过的细菌细胞涂布在培养平板上。在进行第一次实验时，感受态细胞不是自己制备的，结果，在所有的平板上都长出了多到无法计数的菌落(表22．2)o在第二次实验中，自己制备感受态细胞，但这一次，所有的平板上都没有菌落生长(表22．2)o接着又进行了第三次实验，这次得到了转化子(表22．2)。从实验平板上挑出12个菌落，分离了质粒DNA，并用BamH I进行切割，其中9个克隆产生大小同载体一样的单一的一条带，另三个克隆中切出一个cDNA材段，实验终于获得成功。
(1)你如何看待第一次的实验结果?对照重的目的是什么?
(2)影响第二次实验结果的原因是什么?对照2的作用何在?
(3)对照3和4各有什么作用?
(4)为什么要用碱性磷酸酶处理载体?
表22．2 cDNA 克隆的结果
表
注：TMTC=toomanytocount，多到无法计数。
13．打算在细菌中表达一种稀有的人类某种蛋白质，以便能够大量制备这种蛋白。为确保分离纯化，决定将一段6个组氨酸的短肽加到该蛋白质的N端或C端。这些带有组氨酸标签的蛋白质能够紧紧地同Ni2+柱结合，但很容易被EDTA或咪唑溶液洗脱。此法可以一步完成大量蛋白质的纯化。
图22．9是编码该蛋白的核苷酸序列。请设计一对PCR引物，各含有重8个同该基因同源的核苷酸，能够用于扩增该基因的编码序列，另外，在N端有一个起始密码，其后是6个组氨酸密码子。另设计一对引物，能够在C端加上6个组氨酸和一个终止密码。
图22。9
14．从E．coli中分离到一种hemA突变体，这种突变是不可恢复的，并且需要生长在琥珀酸的平板上才能利用6—氨基乙酰丙酸合成血红素。希望利用该突变体去克隆E．coli的hemA基因。首先用Sau3A部分酶切E．coli的DNA，得到的DNA片段平均为2kb，然后将这些片段从BamH工位点克隆到质粒pBR322中，连接后转化hemA突变体。根据氨苄青霉素抗性来选择重组体。将筛选到的氨苄青霉素抗性克隆重植在加有6—氨基乙酰丙酸的平板上进行测试。请问：已经测试的Ampr抗性转化子中有多少不再需要在培养基中添加琥珀酸? (E．coli基因组的全长为4500kb)
15．Raf-1基因编码一种对脊椎动物的发育有重要作用的丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。在果蝇中，当这个基因有缺陷时，胚胎在囊胚期的发育还是正常的，但此后的发育是不正常的，形成一个断尾的胚，也就是缺少后面的四段。在脊椎动物中，成纤维细胞生长因子(FGF)刺激中胚层的诱导和后期的发育， 同时认为，Raf-1蛋白参与了由FGF启动的信号传递。Raf-1蛋白由两部分组成，一部分是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶结构域，即分子的C端(占该分子的1／2)，另一部分是N端的调节结构域，这个结构域在没有接受合适信号的情况下，抑制蛋白激酶的活性。为了检查Raf-1的作用，按照方案设想，改变了ATP结合区的一个关键氨基酸残基，构建一个显性负作用的raf—cDNA。这种突变的cDNA编码一个有缺陷的激酶蛋白质， 命名为NAF(没有功能的Raf).从raf-1 cDNA和NAF的cDNA制备了RNA，并将它们单独地或混合地注射到2—细胞蛙胚胎中，以确定它们对蛙发育的影响。实验结果列于表22．3中。在某些注射体中，短尾的表型非常明显。
(1)请问实验结果能够提供证据证明Raf-1参与脊椎动物后期发育的假设吗?如果可以，那么它们是怎样证明的?
(2)请对Raf-1蛋白进行一些描述，并提出为什么NAF可以作为显性负作用蛋白的
《基因工程》习题集
第一章 基因工程概述
1.什么是基因工程，基因工程的基本流程？
2.基因工程诞生的条件与标志分别是什么？
3.简述基因工程的发展简史。
4.基因工程有哪些主要应用？
5.通过本章的学习，请举两个基因工程应用的具体例子并加以简单说明。
第二章 基因工程的载体和工具酶
1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？
2. 质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？
3. 噬菌体载体有哪些？携带能力分别有多大？
4. 什么是人工微小染色体？有哪些类型？
5. 什么是穿梭载体？
6. 表达载体应该具备什么条件？
7. 限制性内切核酸酶的特点与使用注意事项有哪些？
8. DNA聚合酶和Klenow 大片段各有什么作用？
9. DNA连接酶在什么情况下使用？如何将不同DNA 分子末端进行连接？
10. 碱性磷酸酶有什么作用？
11. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用？
12. 在基因工程研究和应用中，为什么必须使用载体来克隆外源DNA 片段？
13. 分析影响限制性内切核酸酶酶切的因素有哪些？
14. 举例说明大肠杆菌DNA聚合酶Ι在基因工程中的应用。
15. 请描述用载体pUC18 来克隆DNA 片段的过程。在这个克隆实验中，你怎样选择含有克
隆片段的重组子？
第三章 基因工程的常规技术
1. 琼脂糖凝胶电泳的原理是什么
2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素有哪些？
3. 探针有哪些类型？探针标记有哪些方法？
4. 探针的间接标记有什么优点？什么是ABC 荧光（显色酶）标记法？
5. Southern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
6. Northern杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
7. Western杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
8. 菌落（嗜菌斑）原位杂交的基本原理、流程与主要目的分别是什么？
9. 简述PCR技术的基本原理。
10. PCR 反应体系的主要成分与主要程序是怎样的？
11. 提高PCR 反应特异性的因素有哪些？
12. 什么是逆转录PCR？
13. 什么是反向PCR?
14. 什么是多重PCR？
15. 什么是荧光定量PCR？
16. 什么是基因芯片技术？
17. DNA 芯片有哪些主要的应用？
18. 什么是蛋白质芯片？
19. 什么是基因组文库？其构建方法是怎样的？
20. 什么是cDNA文库？它的构建流程是什么？
21. 构建cDNA 文库需要用到哪些工具酶？
22. 合成cDNA 第二条链有哪些方法？
23. 简述酵母双杂交系统的基本原理。
24. 酵母双杂交系统有哪些应用？
25. Sanger双脱氧链终止法DNA 测序的基本原理是什么？
26. Maxam-Gilbert化学修饰法测序的基本原理是什么？
27. DNA 自动测序的基本原理是什么？
28. PCR扩增一个500bp大小的DNA片段，若用凝胶电泳检测，用多大浓度的琼脂糖凝胶？
29. 试述DNA切口平移标记探针的原理。
30. 试述PCR 技术的基本原理，如果想通过PCR技术扩增，然后在大肠杆菌中克隆一个约
500bp的DNA 片段，请描述其克隆过程。
第四章 基因在大肠杆菌、酵母的高效表达
1. 简要分析基因的表达系统的组成。
2. 基于T7噬菌体RNA 聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统的主要优点是什么？
3. 蛋白质的融合表达的原理是什么？
4. 蛋白质融合表达的优缺点是什么？
5. 试述蛋白质的分泌型表达的原理。
6. 蛋白质分泌表达的优缺点有哪些？
7. 蛋白质的包含体形式表达的概念。
8. 蛋白质包含体表达的优缺点有哪些？
9. 蛋白质包含体复性的方法有哪些？
10. 利用大肠杆菌表达系统如何表达人胰岛素？
11. 酵母表达系统有哪些优缺点？
12. 简述甲醇酵母表达系统的主要特点。
13. 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达过程是怎样的？
14．查阅载体pET42a 的结构图，以载体pET42a、宿主菌BL21（DE3）为例，简述作为一
个良好的表达载体需要具备哪些条件？影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素有哪
些？
15．目的基因在大肠杆菌种表达时，为什么常用融合蛋白的表达方式？哪些蛋白或多肽可以
用作担体序列？各有什么特点？
16．简述包含体形成的原因和蛋白质折叠复性的主要方法。
17．简述几种常用甲醇酵母载体的特点和其转入甲醇酵母后的筛选、鉴定方法。
18．列表比较大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞表达系统得优、缺点。
19．自选一种新型的有药用价值的细胞因子，提出基因克隆、蛋白质表达与纯化、生物活性
测定的实验研究方案。
第五章 转基因植物
1. 植物细胞培养技术有哪些？
2. 植物转基因技术的基本路线是什么？
3. 植物转基因的受体系统有哪些？
4. 外源基因导入植物的方法有哪些？
5. 简述Ti质粒的结构特点。
6. 请阐述Ti质粒介导植物基因转移的过程。
7. 植物转基因载体的报告基因有哪些？
8. 提高外源基因在植物体内表达水平的策略有哪些？
9. 什么是抗虫转基因植物？
10. 什么是抗_____病毒转基因作物？
11. 什么是抗细菌和真菌的转基因作物？
12. 什么是抗除草剂转基因作物？
13. 什么是抗非生物胁迫的转基因作物？
14. 什么是植物生物反应器？
15. 什么是转基因生物的安全性？
16. 转基因生物安全性的主要影响因素有哪些？
17．什么是Ti质粒载体，其介导的植物转基因原理如何？
18．什么是基因沉默，导致转基因发生失活的原因有哪些？
19．转基因植物作为生物反应器的优势在哪里？
20．谈谈你对转基因植物的安全性的认识。
第六章 转基因动物
1. 什么是转基因动物？
2. 显微注射法制备转基因动物的主要过程是什么？
3. 逆转录病毒法制备转基因动物的主要过程又是怎样的？
4. 胚胎干细胞的概念。
5. 什么是精子载体法？其制备转基因动物的主要优点是什么？
6. 什么是体细胞核移植法？主要流程是什么？
7. 什么是动物器官生物反应器？
8. 转基因动物有哪些应用？
9. 转基因动物在医药科学研究中的应用有哪些？
10．转基因小鼠的鉴定方法有哪些？
11. 显微注射法制备转基因动物需要哪些设备与装置？
12. 逆转录病毒的结构与基因组特点是怎样的？
13. 基因敲除的概念与操作流程是什么？
14. 简述胚胎干细胞制备转基因动物的流程。
15．什么是ES细胞？它在转基因动物中的应用如何？
16．请举几个动物转基因的方法。
17．比较在细菌、真核细胞和动物个体中表达外源基因的优缺点。
18．谈谈你对转基因动物的安全性问题的认识。
第七章 基因治疗
1. 基因治疗的概念与策略是什么？
2. 基因治疗的基本程序是怎样的？
3. 基因治疗的载体有哪些类型？
4. 腺病毒载体有什么优点？
5. 什么是体外基因治疗？
6. 什么是体内基因治疗？
7. 用于基因治疗的目的基因必须满足哪些条件？
8. 选择基因治疗的靶细胞必须注意哪些问题？
9. 肿瘤的基因治疗的策略有哪些？
10． 什么是自杀基因治疗？
11． 什么是耐药基因治疗？
12. 什么是反义核酸技术？
13. 什么是RNA 干涉技术？
14．基因治疗的病毒载体应该具备哪些基本条件？简述几种常见的病毒载体系统并比较其优
缺点。
15．查阅文献，简述单基因遗传病——进行性肌营养不良和多基因遗传病——先天性心0擵__脏病
的发病机制和基因治疗策略。
16．针对肿瘤的基因治疗有哪几种主要途径？试对每种途径各举一例进行说明。
17． 利用RNA水平上的一些技术对HIV进行基因治疗有哪些方法？对丙型肝炎病毒（HCV）
和SARS冠状病毒的基因治疗方法有哪些呢？
18．评述基因治疗的发展前景。
第八章 蛋白质工程
1. 蛋白质工程的概念。
2. 蛋白质结构层次。一级结构、二级结构、三级结构与四级结构的概念。
3. 结构域与模体的概念。
4. 蛋白质一级结构预测的方法有哪些？
5. 蛋白质加工修饰的类型有哪些？
6. 什么是定点突变？原理是什么？
7. 盒式突变的概念。
8. 什么是定向进化？
9. 什么是易错PCR?
10. DNA 改组的概念。
11．列表比较几种定点突变方法的优缺点。
12．碱性磷酸酶在ELISA 诊断等领域有广泛的应用。为提高碱性磷酸酶的活性，请设计
其定向进化的实验方案。
13．查阅文献，评述绿色荧光蛋白（GFP）的蛋白质工程研究进展和发展趋势。
