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实验三 DNA重组
1 概述
DNA重组技术是70年代分子生物学发展的重大成果，这项成果的主要目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入研究分子基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞及物种个体遗传性状的目的。DNA克隆的一项关键技术就是DNA重组技术。所谓DNA重组技术，就是指把外源目的基因“装进”载体这一过程，即DNA的重新组合。这样重新组合的DNA叫做重组体，因为是由两种不同来源的DNA组合而成的，所以又称为异源嵌合DNA。
载体在DNA克隆中是不可缺少的，目的DNA片段只有与载体片段共价连接形成重组体后，才能进入合适的宿主细胞内进行复制和扩增。作为载体DNA分子，它应具备一些基本性质：
（1）它必须具有能够在某些宿主细胞中独立的自我复制和表达能力，只有这样，外源目的基因装入该载体后，才能在载体的带动下一起复制，达到无性繁殖的目的；
（2）载体分子不宜过大，以便于DNA体外操作，同时载体DNA与宿主核酸应容易分离而便于提纯；
（3）载体上应具有两个以上易于检测的遗传标记，以区分阳性重组子和阴性重组子。选择性标记包括抗药性基因、酶基因、营养缺陷性及形成噬菌斑的能力；
（4）载体应该具有多个限制性内切酶的单一位点，这样容易从中选出一种酶，使它在目的基因上没有切点，保持目的基因的完整性。载体上的酶切位点最好是位于检测表型的遗传标记基因之内，这样目的基因是否连进载体就可以通过这一表型的改变与否而得知，便于筛选重组体。
DNA重组本质上是一个酶促生物化学过程，显而易见，DNA连接酶是其中的重要角色。DNA连接酶主要有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶中的赖氨酸的氨基形成了磷酸-氨基键而连接产生酶-ATP复合物；然后酶-ATP复合物活化DNA链5′端的磷酸基团，形成磷酸-磷酸键；最后DNA链3′端的羟基活化并取代了ATP，与5′端的磷酸根形成磷酸二脂键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接。E.coli DNA连接酶催化DNA分子连接的机理与T4噬菌体DNA连接酶基本相同，只是辅助因子不是ATP而是NAD+。
质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb）且结构简单，质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆，从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段，然后在体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，即可完成。但在实际工作中，如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以将载体的自身环化限制在一定程度之下，也可以进一步采取一些特殊的克隆策略，如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化，还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：
（1）带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端，这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下，常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。
（2）带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物，而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA浓度，以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉，最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连，产生一个带有两个缺口的开环分子，在转入E.coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。
（3）带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇（PEG 8000）以促进DNA分子凝聚成聚集体以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配，则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头（linker）或衔接头（adapter）使其匹配，也可以有控制的使用E.coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端，使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。
本实验所使用的载体为T载体，转化受体菌为E.coli DH5α菌株。由于T载体上带有Amp和LacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。因T载体带有Amp基因而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有T-DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。T载体上带有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点，但并没有破坏LacZ的阅读框架，不影响其正常功能。E.coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下，T载体和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在T载体和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）的存在下被IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到T载体的多克隆位点上后会导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。
2 内容提要
本实验采用粘端连接法将经过PCR扩增的产物插入到T载体中，再进行细胞转化，用α-互补现象和抗性筛选检测重组DNA。通过本实验，了解DNA克隆技术的概念及其在分子生物学研究中的重大意义；掌握DNA重组的方法及鉴别重组子和非重组子的方法。
3 时间表
实验步骤 所需时间
目的基因和T载体的连接 12h
4 主要仪器设备、材料及试剂
主要仪器：
台式高速离心机，恒温水浴锅，微量移液器，eppendorf管、低温涡旋仪等。
材料：
PCR产物，T载体，T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)购买成品；连接buffer等。
试剂：
ddH2O。
5 操作步骤
（1）取新的经灭菌处理的0.5mL eppendorf管，编号；
（2）将0.3μL T载体转移到无菌离心管中，加5μL的PCR扩增产物；
（3）加入10×T4 DNA ligase buffer 1μL，T4 DNA ligase 0.5μL，加蒸馏水至体积为10μL，混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底，于16℃保温8～12h。
连接反应体系为：
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组分 |
体积（μL） |
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T vector |
0.3 |
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Ligase buffer |
1 |
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PCR回收产物(GFP) |
5 |
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T4 DNA Ligase |
1 |
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H2O |
2.7 |
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总体积 |
10 |
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA片段没有质粒载体。
6 结果分析
在涂有X-gal和ITPG的培养基上为蓝色菌落。带有重组DNA的转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，转化菌落呈白色；不含重组DNA的转化子在生色底物X-gal的存在下被IPTG诱导形成蓝色菌落，即蓝白斑筛选。通过蓝白斑筛选可以初步推断，白色菌落为阳性克隆，蓝色菌落为阴性克隆。
如果菌落较大，可直接选取几个平板中间的克隆，进行菌落PCR鉴定；如果菌落较小，可在单菌落周围用无菌接种环划成菌苔，进一步培养后，再进行菌落PCR鉴定。对经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，进行活化培养，提取质粒，进行酶切鉴定，如果酶切鉴定结果正确，说明重组质粒构建成功。还可用杂交法筛选重组质粒。
7 讨论
（1）在连接反应中，一个重要的参数就是温度。理论上讲，连接反应的最佳温度是37℃，因为此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此，人们找到了一个最适温度，即12℃～16℃。此时既可最大限度的发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构的稳定。
（2）DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10～100倍。而在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2～10mg/mL，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100～200mg/mL。
（3）连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
（4）粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10～16℃为好，平齐末端则以15～20℃为好。
（5）在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA 片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。
（6）麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA的转化子为淡红色菌落，而携插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。
（7）X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactoside）以半乳糖苷酶（β-galactosidase）水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG 是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ的表达。因此在含有X-gal和IPTG的筛选培养基上，携带载体DNA的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3～4h可使显色反应充分，蓝色菌落明显。
8 思考题
(1) 在用质粒载体进行外源DNA片段克隆时主要应考虑哪些因素？
(2) 利用α-互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？
参考文献：
[1] Sambrook，J.et al.Moleculer Cloning:A Laboratory Manual，174-184，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.
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[3] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆试验指南，北京:科学出版社，1998.
[4] 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术，北京:科学出版社，1998.
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