连接反应中形成的重组子及其他质粒分子的混合群体必须通过转入宿主细胞将它们相互分离，进而进行自主复制（克隆）。人们发现用Ca²⁺的溶液处理的大肠杆菌细胞易于吸收外源DNA，这一过程被称为转化(transformation)。转化是将异源DNA分子引入另一细胞系的过程，是受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。它是遗传工程的一项关键技术，是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

转化过程所用的受体细胞一般是修饰限制系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用符号R^-、M^-表示。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaCl₂，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许带有外源DNA的载体分子进入的受体细胞(competence cell)。在一定条件下，将带有外源DNA的载体分子与感受态细胞混合保温，使载体DNA分子进入受体细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体(transformant)，即带有异源DNA分子的受体细胞。

目前单一的克隆实验中最常用的宿主细胞仍然是具有限制-修饰系统缺陷的大肠杆菌菌株。大肠杆菌的转化过程是将质粒分子的水溶液或连接反应的混合物与感受态细胞的悬浮液混合放置一定的时间，以使得DNA能被大肠杆菌细胞吸收。但DNA进入细胞的确切机制仍不清楚。将混合溶液于42℃热处理一定的时间，会诱导质粒分子或连接反应的混合物进入细胞，结果提高了转化效率。然后加适量生长培养液于转化细胞中，并在适温下培养，最终涂布于琼脂平板的表面，培养至形成细菌单菌落。同一克隆中的所有细胞均起源于某一单独个体的分裂繁殖，因此同一克隆的所有细胞具有相同的基因型（不包括自发突变，只包括转化步骤中引入的质粒）。

如果转化反应中的所有感受态细胞都能在琼脂平板上生长，则将会形成成千上万甚至上百万的的克隆，且大多数克隆中都不会含有外源DNA分子，这种转化将是无效的。可见需要一种筛选哪个克隆含有质粒或外源DNA的方法。这通常是利用质粒载体携有某一抗生素抗性基因来实现的。例如β-内酰胺酶基因（Amp^r）赋予对氨苄青霉素抗性。若将转化的细胞涂布于含有氨苄青霉素的平板，则只有那些含有被转化质粒从而表达β-内酰胺酶基因的细胞才能生存并生长增殖。这样可以确定转化后在氨苄青霉素平板上形成的克隆都是从携有完整β-内酰胺酶基因的质粒的单个细胞增殖而成。如果转化中使用的是连接反应混合物，此时并不能确定哪些克隆是含有目的片段的重组质粒。一旦获得一群重组子克隆，首先要确定哪些克隆是含有插入目的片段的重组质粒。在多数情况下如DNA文库的筛选，有必要从成千上万甚至上百万的的克隆中筛选出目标克隆。在单一亚克隆实验中，要求实验设计应该充分体现重组子克隆的产率，例如可采用碱性磷酸酶处理载体。

本实验以E.coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl₂处理受体菌使其处于感受态，然后与连接反应混合物共保温实现转化。T载体带有LacZ基因，其编码β-半乳糖苷酶在Xgal-IPTG培养基平板上可以发生显色反应，根据此原理，已经在某些插入型的λ噬菌体载体的LacZ基因中引入了若干常用的限制性核酸内切酶的识别位点。当外源的DNA片段插入到这些克隆位点时，形成的是无功能活性的β-半乳糖苷酶。于是被感染的大肠杆菌寄主细胞就会在含有Xgal-IPTG培养基平板上形成无色的噬菌斑，相反，没有外源基因插入的λ噬菌体载体则会形成蓝色的噬菌斑。同样的方法也可以适用于替换型载体的重组体分子的选择，但其先决条件是在可取代的区段中应带有LacZ基因的相应序列。由此可见，可以利用LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶的功能活性作为选择λ重组体分子的一种简便有效的生化指标，因而接受了该连接产物的受体菌就具有抗氨苄青霉素的特性。转化体经过进一步纯化扩增后，可再将转入的DNA分离提取出来，进行重复转化、电泳、电镜观察，并做限制性内切酶图谱、分子杂交或测序等实验鉴定。

    本实验以CaCl₂制备E.coli DH5α感受态细胞，转化连接产物，并用含抗生素的平板筛选转化体。通过本实验，了解细胞转化的过程及其在分子生物学研究中的意义，学习CaCl₂制备E.coli DH5α感受态细胞和外源基因转入受体菌感受态细胞，以及蓝白斑筛选转化体的方法。

步骤                                     所需时间

制备E.coli DH5α感受态细胞                   1d

         转化细胞与平板筛选                          1-2d

恒温摇床、恒温培养箱、超净工作台、恒温水浴锅、低温离心机、移液器、分光光度计、离心管、液氮、制冰机、高压灭菌锅等。

E.coli DH5α菌株，实验三的连接产物，质粒等。

① 0.1mol/LCaCl₂的配制：称取0.147g CaCl₂·2H₂O

② LB培养基的配制：

10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物及5gNaCl溶于用水定容至1000mL并高压蒸汽灭菌。若要配制含氨苄青霉素的LB培养基，则将15g琼脂加1L　LB培养基中并高压灭菌，待冷却至55℃，向其中加入适量的氨苄青霉素（终浓度30～50mg/L）。

③ 氨苄青霉素贮存液：50mg/mL(溶于无菌水中)，保存于-20℃

④ X-gal 储液（20mg/mL）：用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/mL 的储液，包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏，储存于-20℃。

⑤ IPTG 储液（200mg/mL）：在800μL蒸馏水中溶解200mg IPTG 后，用蒸馏水定容至1mL，用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于-20℃。

⑥ 含X-gal IPTG筛选培养基：在事先制备好的含50μg/mL Amp 的LB平板表面加20μL X-gal储液和4μL　IPTG储液，用无菌玻棒将溶液涂匀，置于37℃下放置30min，使培养基表面的液体完全被吸收。

    ① 用接种针挑取宿主菌(DH5α)在LB琼脂平板上划线，37℃培养16h左右；

    ② 挑取单菌落接种到含50mL LB的250mL三角瓶中，37℃剧烈振荡(300rpm)培养，至OD₆₀₀达0.1～0.2；

    ③ 无菌条件下将培养物转移至冰预冷的2mL离心管中，冰浴10min；

    ④ 4℃ 12，000rpm离心10min，收集细胞；

    ⑤ 倒出培养液，倒置离心管1min，使液体流尽；

    ⑥ 用5mL冰预冷的0.1M CaCl₂重悬细胞，冰浴10min；

    ⑦ 同条件④离心，收集细胞；

    ⑧ 重复⑤、⑥、⑦一次；

    ⑨ 用2mL冰预冷的0.lM CaCl₂重悬细胞(每50mL初始培养物用2mL冰浴冷CaCl₂重悬细胞)；

⑩ 将CaCl₂菌悬液放置4℃ 12～20h，然后加甘油至终浓度为20％，充分使甘油与CaCl₂菌悬液混匀。分装成每份200μL，贮存于-70℃。

① 取一管感受态细胞于冰上冻融后，于无菌条件下加入一定量的连接产物或质粒(20ng/μL的DNA加入lμL即可)。轻轻混匀后，冰浴30min，同时设置两个对照：其中一个在相同条件下加入10ng已知质粒作阳性对照，也可同时检测感受态细胞效价（每ug质粒DNA转化出的菌落数）；另一个加lμL无菌水作阴性对照。

② 42℃水浴静置热激90秒。

③ 将管迅速转移至冰浴中，冰置2min。

④ 往管中加入600μL LB液体培养基，37℃摇床上，200rpm，温育45min，使细菌复苏。

⑤ 按适当的体积梯度，将细菌液铺于含Amp、Xgal-IPTG的琼脂平板上。待液体完全浸入培养基后，倒置平板在37℃培养12～16h。

感受态细胞效价计算：以转化率表示，即每微克质粒DNA转化所得到的转化子数。   

统计每个培养皿中的菌落数。 

转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 

转化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积； 

转化频率（转化子数／mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量(mg)； 

感受态细胞总数＝对照组菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积； 

感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数。 

[注意] 本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。但它们的转化效率不一定相同。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板，而有的转化效率低，涂板时必须将菌液浓缩(如离心)，才能较准确的计算转化率。 

 

   若将上述经培养的转化反应液铺板后，长出的菌落太密，则可进行适当梯度稀释后再铺板。铺板操作需在超净工作台中进行。待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养。统计每个培养皿中的菌落数，各实验组培养皿内菌落生长状况如下表所示：

表3-1 培养皿内各实验组菌落的生长状况及结果分析

	不含抗菌素平板	含抗菌素平板	结果说明
受体菌对照组	有大量菌落长出	无菌落长出	本实验未产生抗药性突变株
DNA对照组	无菌落生长	无菌落长出	质粒DNA溶液不含杂菌
转化实验组	有大量菌落长出	有菌落长出	质粒进入受体细胞便产生抗药性

    由上表可知，转化实验组含抗菌素平板上生长的菌落即为转化体，根据数据则可计算出转化体数和转化频率，计算公式如下：

转化体数=菌落数×稀释倍数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）；

转化频率=转化总数/加入质粒DNA的质量；

再根据受体菌对照组不含抗生素平板上检出的菌落数，则可求出转化反应液内受体菌总数，进一步计算出本实验条件下，由多少受体菌可获得一个转化体。

（1）为提高转化率须思考以下几个重要因素：

① 细胞生长状态和密度。细胞生长不足或过高均会使转化率下降，一般以每毫升培养液的细胞数在5×10⁷个范围为好。要使用新鲜的培养液，否则效果不佳。受体菌生长状况可用分光光度计来测定，不同菌株的合适OD值是不一样的，因为OD值与细胞之间的关系随菌株的不同而异。

② 转化质粒DNA的浓度和质量。转化率与所加DNA浓度在一定范围内成正比，但当DNA量过多或体积过大时，则会使转化率下降。用于转化的质粒DNA应主要是cccDNA（即共价闭合或超螺旋DNA）。

③ 试剂的质量与污染。所用的试剂如CaCl₂等应是分析纯，且最好保存于干燥的荫凉的暗处。整个过程需要注意防止杂菌的污染和其他DNA的污染；所用器皿如离心管、分装用的微量离心管等一定要干净，最好是新的；并在整个实验过程中要无菌操作。少量其他试剂在器皿中残留或DNA的污染均会影响转化率。实验中凡涉及溶液的移液管、分装等敞开实验器皿的操作，最好在无菌超净台中进行以防污染。

④ 若在不该长出菌落的平板上长出了菌落（如阴性对照板），首先考虑是否抗生素已失效，若排除了这一因素，则说明实验有污染（如所用的离心管、器皿等）；如果长出的菌落相对于转化实验组的平板上长出的菌落而言，数量极少（一般在5个以下），则此次转化还算成功，可继续以后的实验；如果长出的菌落很多，则需要设计对照实验，分析找出原因后，再决定是否重新进行转化。

⑤ 本实验方法适用于E.coli各菌株，但同一菌株与不同质粒DNA间的转化效率是不一样的，有的重组质粒转化率会很低。

（2）转化是DNA扩增和体内进行基因研究的关键步骤。转化有多种方法，常用的有氯化钙法、氯化铷法、一步法。与其他两种方法相比一步法较简易，它无需离心、漂洗、热处理以及特殊的仪器（如电穿孔法）。另外在PEG、DMSO和Mg²⁺存在的情况下可获得较高的转化率。感受态细胞在不作任何处理的情况下在所在溶液中可保存长达3个月以上。

（3）一般认为冰冷氯化钙溶液处理可使细菌进入“感受态”，而热休克则使细菌的细胞膜张开，这样DNA得以进入细胞。迄今人们为提高转化率对这一技术进行了许多改进。本实验所介绍的氯化钙法是一种简便、快速的方法。使用本法进行转化，每微克超螺旋质粒（pGEM系列）可产生10⁷个转化菌落。

（4）感受态细胞的质量可以通过测定某一特定样品的转化率来衡量，转化率定义为每微克用于转化的DNA在选择平板上所形成的菌落数。这里DNA为纯质粒，通常是在克隆实验中的载体。转化率的变动幅度很大，可以从粗放转化程序的10⁵个菌落/微克到精细转化程序高于10⁸个菌落/微克。粗放转化程序只适合完整质粒转入新的宿主菌，而精细转化程序所精心制备的感受态细胞可用于文库的构建。约10⁵个菌落/微克的转化率足以满足简单克隆实验。

（5）一般培养液中必须含有原平板筛选转化子所用的抗生素，以维持对质粒有无的选择。部分质粒在长期无筛选压力的生长条件下会从宿主菌体内丢失，因为那些偶然丢失了质粒后能以耗能少的方式复制的细菌将会淘汰那些携带质粒的细菌。扩增的质粒可以用小量法从培养基中制备。通常在这一时刻要制备培养物的保存液，方法是将培养物分散于含有一定浓度的甘油溶液中保存，甘油的作用是保护细胞冰晶形成的伤害（甘油贮液）。这样的贮液能使同一菌株（质粒）在必要时被接种增殖并再次制备。

 

    影响转化效率的因素主要有哪些？

[1] Sambrook，J.et al.Moleculer Cloning:A Laboratory Manual，174-184，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989.

[2] 张龙翔等.生物化学试验方法和技术，北京:高等教育出版社，1981。

[3] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆试验指南，北京:科学出版社，1998.

[4] 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术，北京:科学出版社，1998.

[5] 吴乃虎.基因工程原理（第二版），北京:科学出版社，2000.