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实验五 质粒DNA的提取
1 概述
把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体(Vector)。载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。作为基因工程的载体必须具备下列条件：（1）是一个复制子。载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖。只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，以便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tcr），抗新霉素基因（Ner），抗卡那霉素基因（Kan），抗氨苄青霉素基因（Amp）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离出来。细菌质粒具备上述条件，所以是重组DNA技术中常用的载体之一。
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1～200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型：严紧控制型(Stringent control)和松驰控制型(Relaxed control)。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如ColEI质粒。在使用蛋白质合成抑制剂——氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，严紧型质粒复制停止，而松驰型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000～3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40%～50%。
利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。
质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。
质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链 DNA、体外转录外源 DNA 序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：（1）分子量小、多拷贝、松驰控制型；（2）具有多种常用的限制性内切酶的单切点；（3）能插入较大的外源DNA片段；（4）具有容易操作的检测表型。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。
从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用溶菌酶可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和Triton X-100可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于水相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA(Open circular DNA，简称ocDNA)；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(Linear DNA)。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快，因此在本实验中，自制质粒在电泳凝胶中呈现1～3条带。超螺旋链迁移率最大，线状质粒次之，开环质粒迁移率最小。
2 内容提要
本实验用碱裂解法从大肠杆菌细胞中快速分离、小量提取质粒DNA，在经过限制性内切酶酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分离，用凝胶成像系统检测。通过对本实验的学习，了解煮沸法、Wizard等方法小量、大量提取纯化质粒方法；掌握碱裂解法小量提取纯化质粒方法，限制性内切酶酶切等技术和方法等。
3 时间表
步骤 所需时间
细菌培养 12h
质粒的提取 5h
琼脂糖凝胶电泳检测 2h
酶切鉴定 14h
4 主要仪器、材料和试剂
主要仪器：
恒温摇床，低温高速离心机，移液器，恒温水浴锅，涡旋振荡器，电泳仪，制
冰机，凝胶成像系统等。
材料：
含质粒的E.coli DH5α或JM系列菌株，1.5mL塑料离心管(又称eppendorf管)，离心管架，枪头等。
试剂：
1）LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，NaCl 10g，溶于800mL去离子水中，用NaOH调pH至7.5，用去离子水定容至1升，高压灭菌20min。
2）LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
3）氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)母液：配成50mg/mL水溶液，-20℃保存备用。
4）溶菌酶溶液：用10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)溶液配制成10mg/mL，并分装成小份(如1.5mL)保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。
5）3mol/L NaAc(pH5.2)：50mL水中溶解40.81g NaAc·3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100mL，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。
6） 溶液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。 溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100mL，高压灭菌15min，储存于4℃冰箱。
7）溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/L NaOH母液稀释），1％SDS。
8）溶液Ⅲ：5mol/L KAc60mL，冰醋酸11.5mL，H2O28.5mL，定容至100mL，并高压灭菌。溶液终浓度为：[K+] 3mol/L，[Ac-] 5mol/L。
9）RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/L Tris·Cl(pH7.5)，15mmol/L NaCl中，配成10mg/mL的溶液，于100℃加热15min，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mLeppendorf管分装成小份保存于-20℃。
10）饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉(作为抗氧化剂)，并用等体积的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/L Tris·Cl(pH8.0)缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。
11）氯仿：按氯仿:异戊醇＝24:1的体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积＝1:1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿(1:1)。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。
12）TE缓冲液：10 mmo/L Tris·Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA (pH8.0)。高压灭菌后储存于4℃冰箱中。
13）STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）， 5%Triton X-100。
14）STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。
15）电泳所用试剂：① TBE缓冲液（5×）：称取Tris 54g，硼酸27.5g，并加入0.5M EDTA（pH8.0）20mL，定溶至1000mL。② 上样缓冲液（6×）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。
５ 操作步骤
（1）细菌的培养和收集
将含有质粒的DH5α菌种接种在LB固体培养基（含50μg/mL Amp）中，37℃培养8～12h。用无菌牙签挑取单菌落接种到5ML LB液体培养基(含50μg/mL Amp)中，37℃振荡（200rpm）培养约8～12h至对数生长后期。
（2）质粒DNA少量快速提取
质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要，本书只列举碱裂解法提取质粒的方法。
碱裂解法快速小量提取质粒DNA的基本步骤：
① 取1.5mL培养液倒入1.5mL eppendorf管中，4℃下12000g离心30s；
② 弃上清，将管倒置于卫生纸上数min，使液体流尽；
③ 菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中(需剧烈振荡)，室温下放置5～10min。
④ 加入新配制的溶液Ⅱ200μL，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要剧烈振荡），冰浴5～10min；
⑤ 加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5～10min，4℃下12000g离心5～10min；溶液Ⅰ：Ⅱ：Ⅲ的比例为1:1.5:2；
⑥ 上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4℃下12000g离心5min。
⑦ 将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20℃冰箱中20min，然后4℃下12000g离心10min；
⑧ 弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1mL70％乙醇洗沉淀一次，4℃下12000g离心5～10min；
⑨ 吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10min或室温干燥；
⑩ 将沉淀溶于20μL TE缓冲液（pH8.0，含20μg/mLRNaseA）中，储于-20℃冰箱中保存备用。
[注意]
① 提取过程应尽量保持低温；
② 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量去除干净，需多次抽提；
③ 沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积)，且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。
（3）质粒DNA的大量提取和纯化
在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。
碱裂解法快速大量提取质粒DNA的基本步骤：
① 取培养至对数生长后期的含质粒的细菌培养液250mL，4℃下5000g离心15min，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽；
② 将细菌沉淀重新悬浮于50mL用冰预冷的STE中（此步可省略）；
③ 同步骤1方法离心以收集细菌细胞；
④ 将细菌沉淀物重新悬浮于5mL溶液I中，充分悬浮菌体细胞；
⑤ 加入12mL新配制的溶液II，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10min。
⑥ 加9mL用冰预冷的溶液III，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15min，此时应形成白色絮状沉淀；
⑦ 4℃下5000g离心15min；
⑧ 取上清液，加入50mL RNA酶A（10mg/mL），37℃水浴20min；
⑨ 加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10min；
⑩ 取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4℃下12000g离心10min；
⑾ 取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60min；
⑿ 4℃下12000g离心15min，沉淀用数毫升70%冰冷乙醇洗涤，4℃下12,000g离心5min；
⒀ 真空抽干沉淀，溶于500 mLTE或ddH2O水中，储于-20℃保存备用。
[注意]
① 提取过程中应尽量保持低温；
② 加入溶液II和溶液III后操作应混和，切忌剧烈振荡；
③ 由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（80℃ 1h），使DNA酶失活。
6 结果与分析
对分离好的质粒用琼脂糖凝胶电泳进行分离，如果泳道中出现1~3条带，就说明此次实验是成功的。还可以通过带的亮度初步推断质粒的多少，一般，带越亮说明质粒的量越多。另外，如果在点样孔内有发亮的物质，可以判断为蛋白质没有去除干净，可以用氯仿多抽提几次。如果在远离点样孔端有亮带，说明RNA没有消化干净，可以加适量的RNA酶在37℃消化30min，只有得到高质量的没有蛋白质和RNA干扰的DNA后，才能确保下一步试验的顺利进行。
７ 讨论
核酸分子迁移率与琼脂糖浓度的关系
DNA的分子大小：DNA分子通过琼脂糖凝胶的速度（电泳迁移率）与其相对
分子质量的常用对数成反比关系。
琼脂糖浓度：一定大小的DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中，电泳迁移率不同。DNA的电泳迁移率（M）的对数和凝胶浓度（T）之间的线性关系可按下述方程式表示：
lgM=lgM0-KrT
其中，M0时自由电泳迁移率，Kr是滞留系数，这是与凝胶性质、迁移分子大小和形状有关的常数。因此，要有效的分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖浓度是非常重要的（参看表5-1）
表5-1 琼脂糖凝胶浓度与分辨DNA大小范围的关系
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琼脂糖凝胶浓度 |
0.3 |
0.6 |
0.7 |
0.9 |
1.2 |
1.5 |
2 |
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可分辨的线性DNA大小范围/kb |
60~5 |
21~1 |
10~0.8 |
7~0.5 |
6~0.4 |
4~0.2 |
3~0.1 |
琼脂糖浓度与电压的关系：有人研究了琼脂糖凝胶电泳分离大分子DNA的条件，发现以低浓度、低电压分离效果较好。胶的浓度越低，适用于分离的DNA越大，这是一个总的规律。不过浓度太低，制胶有困难，电泳结束后将胶取出来也有困难。在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用电压成正比。当电压增高时，电泳分辨率会下降。因为电压升高了，样品的流动速度增快，大分子在高速流动时，分子伸展开了，摩擦力也增加，相对分子质量与迁移速度就不一定呈线性关系。
8 思考题
（1）质粒的基本性质有哪些？
（2）质粒载体与天然质粒相比有哪些改进？
（3）在碱裂解法提取质粒DNA的操作过程中应注意哪些问题？
参考文献
[1] 张龙翔等.生物化学试验方法和技术，高等教育出版社，北京，1981。
[2] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆试验指南，科学出版社，1998.
[3] 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术，科学出版社，1998.
[4] 吴乃虎.基因工程原理（第二版），科学出版社，2000. |