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1概述
基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性，可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团悬浮其中，可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部，从而达到提取的目的。在提取过程中，染色体会发生机械断裂，产生大小不同的片段，因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作，如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓，以保证得到较长的DNA。一般来说，构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上，否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP 和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段（20kb 以下），并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb 以下）。
不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法，以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用，因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时，应考虑除去多糖和酚类物质。
本实验以烟草为材料，学习基因组DNA提取的一般方法。
2 内容提要
利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有SDS（十六烷基磺酸钠）或CTAB（十六烷基三乙基溴化胺），都是去污剂，可溶解细胞膜，能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/L的NaCl）是可溶的，当降低盐浓度到一定程度时（0.3mol/L的NaCl），会从溶液中沉淀，通过离心就可以将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开，蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来；EDTA抑制DNA酶的活性；用酚/氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液再经乙醇沉淀，然后再溶于去离子水或TE缓冲液，用RNA酶消化RNA后，就可得到DNA。
3时间表
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实验步骤 |
所需时间 |
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配制溶液 |
1h |
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提取植物DNA |
6h |
4主要仪器、材料和试剂
主要仪器：
移液器，高速冷冻离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50mL离心管（有盖）及5mL和1.5mL离心管，弯成钩状的小玻棒。
材料：
植物的幼嫩组织。
试剂：
（1）CTAB法提取烟草幼苗或其它禾本科植物的幼嫩组织的基因组DNA所需的试剂：
① 提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl，1.5% SDS；
② 提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0g PVP，240µL β-巯基乙醇，加水至300mL；
③ 24:1/氯仿:异戊醇；
④ RNase A母液；
⑤ 2×CTAB提取缓冲液：0.1ＭTris Cl（pH8.0），20mmol/L EDTA，1.4mol/L的 NaCl，2% CTAB，40mmol/L的β-巯基乙醇（最好在使用前加）；
⑥ 10%CTAB：10%CTAB、0.7 mol/L NaCl；
⑦ 1×CTAB沉淀缓冲液：50mmol/LTris Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA，1% CTAB，20mmol/L的β-巯基乙醇（最好在使用前加）；
⑧ 1mol/L乙酸胺，7.5 mol/L乙酸胺；
⑨ 其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。
（2）改进的CTAB法提取新疆特殊植物基因组DNA所需的试剂：
① 提取缓冲液：0.35M葡萄糖，0.1ＭTris Cl（pH8.0），5 mM Na2-EDTA，2%PVP（聚乙烯吡咯烷酮），0.1% DIECA （2-乙基-2硫代氨基甲酸）；
② 裂解缓冲液：0.1ＭTris Cl（pH8.0），1.4 M NaCl，0.02M Na2-EDTA，2% CTAB，2%PVP，0.1% DIECA，20mM的β-巯基乙醇（最好在使用前加）；
5 操作步骤
（1）用CTAB法提取烟草幼苗或其它禾木科植物基因组DNA
① 取1～2g新鲜植物材料，于液氮中研成粉末；
② 将研好的粉末立即倒入冷冻的2mL离心管中，加入500 μL等体积65℃预热的2×CTAB提取缓冲液，剧烈摇动混匀，65℃水浴保温30～60min（时间长，DNA产量高），不时摇动；
③ 加入500 μL氯仿/异戊醇溶液，轻轻颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5～10min，10000rpm离心10min；
④ 将上清转入另一离心管中，加入1/10体积的10%CTAB，加入等体积氯仿/异戊醇溶液，轻轻颠倒混匀，室温下静置5～10min，10000rpm离心10min；
⑤ 取上清，重复④；
⑥ 将上清转入另一离心管中，加入1～1.5倍体积的1×CTAB沉淀缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温下静置30～60min，观察沉淀生成。如无明显的沉淀生成，可延长放置时间，沉淀量会增加；
⑦ 4000rpm离心10min，去上清，风干沉淀，纯化备用；
⑧ 加入一定量的1mol/L乙酸胺，使沉淀完全溶解，再加入一定量的7.5mol/L乙酸胺，使乙酸胺的浓度达到2.5mol/L；
⑨ 加入2倍体积的异丙醇，混匀，室温放置至沉淀生成，用玻棒挑出沉淀，或离心，弃去上清；
⑩ 用70%的乙醇漂洗沉淀，风干，溶于适量的TE或去离子水中，用适量的RNA酶消化后储于-20℃备用。
（2）用改进的CTAB法提取烟草幼苗或其它禾木科植物基因组DNA
① 取1～2 g新鲜植物材料，于液氮中研成粉末；
② 将研好的粉末立即倒入冷冻的离心管中，加入500μL提取缓冲液，剧烈震荡，12000rpm离心10min；
③ 弃上清，于沉淀中加入65℃预热的裂解缓冲液，轻轻摇动混匀，65℃水浴保温30～60min（时间长，DNA产量高），期间不时摇动，12000rpm离心10min；
④ 取上清，加入500 μL氯仿/异戊醇溶液，轻轻颠倒混匀（需带手套，防止损伤皮肤），室温下静置5～10min，12000rpm离心10min；取上清，重复④；
⑤ 将上清转入另一离心管中，加入一定体积的异丙醇，混匀，室温放置至沉淀生成，用玻棒挑出沉淀，或离心，弃去上清；
⑥ 用70%的乙醇漂洗沉淀，风干，溶于适量的TE或去离子水中，用适量的RNA酶消化后储于-20℃备用。
6 结果分析
对所提取的植物总DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，如果在点样孔附近有明显的条带，说明有DNA，其亮度可以可以粗略代表提取的量；如果在远离点样孔的位置有明显的条带，说明RNA没有消化干净，如果要进行PCR或酶切，还需要进一步消化RNA。
7 讨论
在植物DNA的提取过程中，影响提取数量和质量的因素很多，主要有以下几方面需要注意：
（1）所用的植物材料。在选择材料时，一般选用较幼嫩的叶片，并除去叶脉。过老或过嫩的叶片中DNA的含量都较低，而且过老的叶片中因酚类或多糖的含量增加而影响DNA的提取。
（2）所用的提取方法。根据不同的植物选用不同的提取方法，常用的提取方法主要有SDS法和CTAB法，但是对不同的植物材料还要根据需要对传统方法进行改造，如很多实验室根据自己的经验，总结出了自己的“家传秘方”，在特定植物的DNA提取中是非常有效的。
8 思考题
在DNA的提取过程中如何检测和保证DNA的质量？
参考文献：
[1] 张龙翔等.生物化学试验方法和技术，高等教育出版社，北京，1981。
[2] J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆试验指南，科学出版社，1998.
[3] 王关林，方宏筠.植物基因工程原理与技术，科学出版社，1998.
[4] 吴乃虎.基因工程原理（第二版），科学出版社，2000.
[5] 郝福英等.分子生物学实验技术，北京大学出版社，1998. |